仙人掌多糖的提取_分离纯化及GPC法测定其分子量

文章篇号:1007-2764(2006)02-0138-044
仙人掌多糖的提取、分离纯化及GPC法测定其分子量
金鑫，赖凤英
(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640)
摘要：研究了仙人掌多糖水提法的最佳工艺条件,以及仙人掌多糖的分离纯化。

试验结果表明,提取液用Savag法脱蛋白后，采用Sephacryl S-400柱层析纯化，得到仙人掌多糖OP，经过高效凝胶渗透色谱和常压凝胶柱色谱分析表明，OP为均一多糖，高效液相凝
胶色谱法测定OP分子量(Mw)为172591Da。

关键词：仙人掌多糖；提取；分离纯化；分子量测定
Extraction、Isolation and Purification of Polysaccharides in Opuntia and Determination of its molecular weight by GPC method
Jin Xin, Lai Feng-ying
(College of light industry and Food, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract The extraction technology、separation and purification of the polysaccharide from opuntia was studied in this paper. By using Savag method, almost all protein was removed from the extracted juice. Then the polysaccharide was purified by Sephacryl S-400 gelcolumn chromatography, and OP was gained. Its homogeneity is verified by HPGPC and Sephadex G-200 column chromatography. And the molecular weight of OP is 172591Da by the determination of HPGPC.
Keywords: Opuntia; Polysaccharide; Extraction; Isolation; Purification; Determination of molecular weights
仙人掌，别名仙巴掌、观音掌、霸王树、龙舌等，为仙人掌科仙人掌属植物，原产于美洲、墨西哥一带，广泛分布于非洲、亚洲、美洲等热带和亚热带地区[1]。

仙人掌属肉质植物，具有较强的药理活性，如抗炎作用、降血糖作用、保护细胞免受损伤作用等[2]。

为探明仙人掌的药理作用及药理活性的物质基础，实验对仙人掌多糖的提取工艺和分离纯化两方面进行研究。

1 材料和方法
1.1 材料和试剂
米邦塔仙人掌：购于海南省仙科农业开发有限公司，晒干，磨粉备用。

试验所用3，5－二硝基水杨酸，葡萄糖，苯酚，硫酸、氯仿、正丁醇、磷酸二氢钾等均为分析纯。

Sephacryl S-400 HR凝胶填料：Amersham公司。

Sephadex G-200凝胶填料：Pharmacia公司。

1.2试验仪器
旋转蒸发仪，电热恒温水浴锅，Waters 2410示差折光检测器，Waters 717plus自动进样器，Waters15
收稿日期:2005-12-02
作者简介：金鑫，，在读研究生，天然产物提纯分离以活性研究 25 HPLC泵，柱温箱，S21-6型电子恒温水浴锅,80-2型离心机，HL-2A恒流泵,DBS-100电脑全自动部份收集器,Unico-UV21202PC紫外-可见分光光度计、层析记录仪。

1.3多糖含量分析方法
多糖含量＝(总糖含量－还原糖含量)×100％；
总糖：采用苯酚－硫酸法测定，以葡萄糖为标准；
还原糖：采用3，5－二硝基水杨酸比色法测定。

1.4 多糖提取方法
准确称取1g仙人掌干粉，加入一定量蒸馏水，置于烧杯，放入恒温水浴中提取多糖一定时间后，抽滤，取滤液 1ml，测量总糖、还原糖含量，计算多糖含量。

先做单因素试验，然后根据单因素试验结果进行正交试验。

1.5 仙人掌多糖提取工艺条件研究
热水浸提工艺涉及三个关键条件：提取时间、提取温度和液料比。

在单因素实验的基础上，针对这些因素的影响规律，采用正交法确定水提法提取多糖的最佳提取条件。

1.5.1 提取时间的影响
在确定固液比为1：50，提取温度为60℃不变的
138
条件下，比较不同提取时间对多糖提取率的影响，以选择最佳提取时间。

1.5.2 提取温度的影响
固液比仍为1：50 ，浸提时间由上一实验确定，分别在不同温度条件下浸提，根据其多糖提取率确定最佳提取温度。

1.5.3 液固比的影响
在上述实验确定的浸提时间及温度下，选择固液比分别为1：30、1：40、1：50 、1：60、1：70及1：80，根据其多糖提取率确定最佳固液比。

1.5.4 正交试验设计
1.6 蛋白质的去除
仙人掌浸提液中除了含有大量的多糖外,还含有一定量的蛋白质及其他非糖杂质。

目前用于多糖除蛋白的方法有Savag法、三氟三氯乙烷法、及三氯乙酸(TCA)法[3], 其中Savag法去蛋白虽然效率不高，但条件温和，不会引起多糖的降解。

因此，本实验采用Savag法反复除蛋白。

1.7 仙人掌多糖的凝胶柱层析纯化[4]
上样量10mg,上样体积1mL,上样到已用0.2 moL/L的Nacl溶液平衡好的Sephacryl S-400 HR柱(1.6×30cm)上，用0.2moL/L的Nacl溶液洗脱, 流速为0.2ml/min ,用自动分部收集器收集洗脱液, 每管收集2ml，以苯酚-硫酸法跟踪检测。

合并主峰部位，透吸，减压浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥。

1.8 多糖纯度鉴定
1.8.1 高效液相凝胶色谱（HPGPC）法
将仙人掌多糖溶于0.02moL/L磷酸二氢钾溶液，制成1.0mg/ml的溶液，离心过滤，进样20µL，流动相为0.02moL/L磷酸二氢钾溶液，流速为0.6ml/min，Waters 2410示差折光检测器检测。

1.8.2 常压凝胶柱色谱法[5]
上样量5mg,上样体积1mL,上样到已用0.1mol/L 的Nacl溶液平衡好的Sephadex G-200柱(1.0×50cm)上，用0.1moL/L的Nacl溶液洗脱, 流速为0.2mL/min,用自动分部收集器收集洗脱液, 每管收集1ml，以苯酚-硫酸法跟踪检测。

1.9 凝胶渗透色谱法（GPC）测定多糖分子量[6]
色谱条件：TSK G-5000 PW×L凝胶柱，TSK G-3000 PW×L凝胶柱；流动相为0.02mol/LKH2PO4溶液，PH6.0；流速0.6mL/min；柱温40。

C；进样20µL；标样为已知分子量的葡聚糖标准品（Dextran，分子量为4400Da，21400Da，124000Da，196000Da，277000Da，401000Da，Sigma公司）；检测器为Waters 2410示差折光检测器。

测定方法：将已知分子量的葡聚糖标准品分别用流动相配制成1.0mg/ml的溶液，进样量为20µL，记录色谱图，用BreezeGPC软件以标准葡聚糖分子量的对数logM W对洗脱体积Elution V olume进行回归处理[7]。

将多糖样品用流动相配制成1.0mg/ml的溶液，进样20µL，测得多糖样品的保留时间，利用标准曲线求得多糖分子量。

2 结果与讨论
2.1 正交试验确定最佳提取工艺条件
影响水提法提取多糖提取得率的因素很多，如提取时间、温度、固液比等，在单因素实验的基础上，针对这些因素的影响规律，采用正交法确定水提法提取多糖的最佳提取条件，因素水平见表１，正交实验结果见表2和表3。

表１ 仙人掌多糖提取因素水平表
水平时间（h）温度(。

C) 固液比
Ⅰ0.5(A1) 70（B1）1:40(C1)
Ⅱ 1 (A2) 80（B2）1:50(C2)
Ⅲ 2 (A3) 90（B3）1:60(C3)
表2 水提法提取仙人掌多糖提取正交结果 实验号 A B C 误差多糖得率(%)
1 A1
B1
C1
1 3.47
2 A1
B2
C2
2 4.76
3 A1
B3
C3
3 5.40
4 A2
B2
C3
1 6.07
5 A2
B3
C1
2 5.78
6 A2
B1
C2
3 4.42
7 A3
B3
C2
1 5.41
8 A3
B1
C3
2 4.56
9 A3
B2
C1
3 5.30
表3 正交实验结果方差分析表
方差来源平方和自由度均方F值临界值
A 1.19 2 0.65
13.57
B 2.27 2 1.14
25.33
F0.05(2,2)
=
19
C 0.74 2 0.42
7.43
F0.01(2,2)
=
99误差0.10 2 0.06
从表3结果可知，影响多糖提取率得因素按影响程度大小排列分别为B＞A＞C。

且由F 值与临界值的比较知提取温度B 对提取率的影响是显著的。

因此，由以上数据可知，水提仙人掌多糖的最佳工艺是：A２B2C3，即提取温度为８０℃，提取时间为1小时，液固比为1：60时为最优的工艺条件。

但由C 因素（固液比因素）对提取率的影响并不明显，所以可以选取固液比较小的工艺条件，有利于后步骤的浓缩提取液，
139
另外提取时间也可以选择为0.5小时，最佳的工艺条件为A1B2C1。

2.2 蛋白质的去除
采用Sevag法，即用氯仿：正丁醇=4：1混合液加至等体积的粗多糖水溶液中，充分振摇，样品中的游离杂蛋白与氯仿-正丁醇生成凝胶物，离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白，如此反复数次，直至溶剂层与水的界面无乳白色沉淀为止。

然后用乙醇沉淀，冷冻干燥。

2.3 Sephacryl S-400 HR凝胶柱层析纯化
Sephacryl S-400 HR凝胶柱上层析，用0.2mol/L 的Nacl溶液进行洗脱, 用层析记录仪在280nm处直接检测洗脱液的蛋白质含量，以及苯酚-硫酸法在490nm 处跟踪检测每管洗脱液，以洗脱时间对吸光度值作图，
为单一对称的洗脱峰，表明OP为均一多糖。

图2 OP的HPGPC色谱 图3 OP的Sephadex G-200柱洗脱曲线 2.5 分子量的测定
Dextran系列标准品的GPC标准曲线图
图5 OP的GPC色谱图及结果
BreezeGPC软件处理，以标准葡聚糖分
W
对洗脱体积Elution V olume进行回
Dextran系列标准品的GPC标准曲线图,
程为logM W=1.03e+002−1.86e+001V+
2 −2.51e−002V3(其中V表示洗脱体积。

图5为OP的GPC色谱图，由标准
的重均分子量Mw为172591Da，数均分
，峰位分子量Mp为346933 Da，分子量分布宽度为1.42。

(下转第149页)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
010 20 304050
管数
140
的作用下水解为水溶性物质[3～5]，山楂中果胶质的含量达3%～4%，山楂中黄酮类水溶性有效成分往往包裹在细胞内。

能否有效和较多地将山楂果可食部分的不溶性成分水解为小分子的可溶性成分，并将黄酮类活性成分充分释放出来，关键在于酶法液化处理的工艺参数和酶制剂状态。

本试验以可溶性固形物和总黄酮含量为指标依据，对果胶酶作用的条件进行了研究。

由于果胶酶是具有生物活性的蛋白质，其分解作用受到温度、时间、浓度等因素的影响，研究中发现酶解温度是影响液化作用的主要因素，当温度过低时酶的活性不能得到充分发挥，过高则酶被钝化，活性下降。

通过正交试验可知，果胶酶合适处理温度为45℃。

优化酶解条件下，总黄酮含量是不经酶解的1.92倍。

3 小结
果胶酶液化山楂果肉最佳工艺参数：酶解温度45℃、酶解酶量0.7mg.g-1、酶解时间3.0h，酶解水量20倍。

参考文献
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table and Fruit Juice, Contructa Studien,1986(30):15～23.
(上接第134页)
3.3 最适合宝庆丸子杀菌的方法是高温杀菌--真空包装—微波杀菌法，杀菌温度121℃，时间25min，微波杀菌的时间3min。

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(上接第143页)
取法提取桃叶中总黄酮的最佳工艺为：将粉碎过筛的桃叶用料液比为1:20（原料质量与溶剂体积比）的70%乙醇，在60℃、225w的超声波功率下萃取40 min。

(2)所得萃取物含较多的叶绿素，需进行进一步纯化研究。

并且，在纯化的同时可以得到叶绿素副产物。

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