大学生科技创新基金结题报告书

扬州大学大学生科技创新基金

项目结题报告书

项目名称：表面活性剂对多酚氧化酶活性影响研究

项目序号：x2015351

负责人：丁炳杰单海文江恒陈宽

所在学院：化学化工学院

起止时间：2015年5月—2016年5月

结题时间：2016年4月30日

扬州大学大学生科技创新基金管理办公室

二○○四年制

一、研究计划要点及执行情况概述

多酚氧化酶（PPO）在食品、医药及环保行业有着广泛应用，提高其活性可以更好地应用于食物储存、植物抵抗病原体及病毒侵害、含酚类有机物工业废水的生物降解等。目前，研究人员一般针对提纯后的多酚氧化酶进行相关研究，包括探究酶的最佳活性条件、表面活性剂（如十二烷基硫酸钠（SDS））对酶活性的激发等，以达到最大可能提高酶活性的目的。

PPO大量存在于植物中，其中苹果中含量丰富，我国苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，并且其在食品储存（如防腐）、医药（如植物抵抗病原体及病毒）、含酚类有机物工业废水的生物降解等方面具有重要利用价值，用途广泛。

近年来，研究人员通过酶催化反应探究各种酶作用机理，不仅能揭开生物催化过程的奥秒，也能为人类利用其中某些原理来研究开发新型高效催化剂奠定科学基础。

多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物中,能氧化酚或多酚形成对应的醌。其在食品、医药及环保行业有着广泛应用，研究其活性可以更好地解决食物储存、植物抵抗病原体及病毒侵害、含酚类有机物工业废水的生物降解等问题

目前，研究人员多数研究提纯后的多酚氧化酶，包括探究酶的最佳活性条件，表面活性剂（十二烷基硫酸钠（SDS））对酶活性的激发，达到酶活性提高至最高的目的。但是提纯后，酚类化合物含量减少以及PPO处于束缚状态可能会对酶活性有影响。

PPO大量存在于植物中，其中苹果中含量丰富，我国苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上。本科创不进行苹果中PPO的提取，而是利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）来提高苹果中PPO 的活性。

二、研究工作主要进展和所取得的成果。

1、要解决的技术问题

如何使用CTAB和DTAB提高苹果中PPO酶的活性。

2、技术方案

（1）从苹果（山东烟台产红富士苹果）中提取PPO粗酶

（2）探究pH、温度、离子强度等因素对多酚氧化酶粗酶活性的影响

（3）探究不同pH、温度和离子强度下DTAB、CTAB对PPO粗酶活性的影响

本专利所用的磷酸盐缓冲溶液pH值为5.8~8、NaCl溶液离子强度为0~5M，温度为20~60℃，[CTAB]:0~1mM，[DTAB]:0~2，13~20mM

3、有益效果

使用CTAB时，当CTAB浓度为0.3-1.0mM、体系pH为7时，PPO酶活性可提高75%左右。使用DTAB时，当DTAB浓度为15mM时，粗酶活性可提高40%。

4、具体实施方式

（1）多酚氧化酶粗酶液的制取

a. 预处理：将苹果在蒸馏水中洗净，擦干，置于-20℃冷冻保存（大于12h）；

b. 粗酶液的抽提：称取58.82 g经过处理的苹果，置于100 mL 磷酸盐缓冲溶液(0.2 M，pH6.5)中，用搅拌机打浆；之后用四层纱布挤压进行过滤，得到的粗滤液在4℃下10000rpm 离心10 min，取上清液备用。

（2）邻苯二酚溶液配制：在磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH7）中配制300mM 邻苯二酚溶液。

(3) 表面活性剂溶液的配制：在水中配制25mM CTAB和60mM DTAB溶液。

（4）PPO酶活性测定（紫外分光光度计）

粗酶活性测定：用移液枪量取12.5 μL蒸馏水稀释25倍粗酶与93.4 μL邻苯二酚溶液及81.6 μL蒸馏水混合，于420nm处检测吸光度值随时间的变化。

加入CTAB、DTAB后粗酶活性测定：用移液枪量取12.5 μL蒸馏水稀释25倍粗酶与93.4 μL邻苯二酚溶液及不同浓度的表面活性剂溶液混合，于420nm处检测吸光度值随时间的变化。

三、存在的问题、纵深研究的建议及其他需要说明的情况

参加大学生科创是件有利于自身的事情，然而由于大三课程比较多，时间比较紧张，我们平时去实验室动手操作的时间很少，查文献的次数也不多，做实验的时候缺乏思考，没有一颗好奇心，难以发现实验中出现的一些问题，与老师沟通交流的机会也不是很多，大多数做实验只是按照老师的要求与指示重复性操作。

本科生进入实验室本身就是一个非常好的机会，它可以让学生更早的接触科研，感受科学的魅力，培养自己的科研意识与素养,同时，跟在老师后面可以提高实验动手能力，开阔自身眼界。此次科创，我们是跟随郭霞老师做的，郭老师为人非常和蔼可亲，对待我们非常有耐心，对于我们的疑惑她都会一一解答，郭老师还是一个知识渊博的老师，作为化院的教授，郭老师发了多篇SCI文章。通过科创，我们提高实验技能，增强了学习斗志，还学会了团队合作的精神，也学会如何去处理人际关系，如何处理好学习、科研、生活三者之间的关系，为我们以后的研究生学习生活奠定了坚实的基础，使我们受益匪浅！

最终科创虽然没有发表文章或者申请专利，但是重要的是过程，通过这个过程我学会了很多仪器操作，如红外、紫外等光谱仪器的使用。科创没有做出来的原因可能是一方面我们这学期课程比较紧张，平时实验做得比较少，另一方面相关的文献看的不多，研究的不够深刻，有问题不主动与老师沟通。

由于我们这是校级科创，学校不提供经费，所有支出都是老师从基金里拿出给我们的，所以希望学校以后能多拿出经费资助科创，尽管只是校级，但经费对学生而言怎么说也是一种鼓励，我相信如果有了经费，学生们做起科创会更有斗志，更感觉到自己肩上的责任感。