生物光子学5-03

Sample area 100x100 µ m
Image area is 512x512 pixels
>> Pixel size (µ m)=100/512
取样间隔
在显微镜中，那些小于数字抽样间隔的结构在数字图像上 无法表示出来--->> Nyquist取样定理或标准
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
缩放因子 通过减小扫描角度来减小扫描区域 减小像素尺寸 改善分辨率
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
应用
•3D重建 沿着Z方向采集一系列2D 图像，从而重构出3D图像 •4D成像：时序采集 在不同时间采集 Z-序列图像，得到4D数据，包括三维空 间 (x, y,z)和一维时间（第四维），采用4D可视化软件进 行观察。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
全场和共焦荧光显微技术
www.microscopyu.com
• 在常规的全场显微镜中，整个样品都被光（汞灯、氙灯等光源）照射，可 以用眼睛直接观察图像，或将图像成像到图像探测器如CCD相机上。 • 在共焦显微镜中，用聚焦光（一般来自激光）沿着样品进行逐点扫描、照 明和探测（用点探测器如PMT和APD），用计算机重构样品的图像。 • 用光束扫描的方法得到的图像是样品的一个光学切片。
主讲人：刘立新
lxliu@xidian.edu.cn 西安电子科技大学
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第5章
生物光子学成像技术
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本章内容
5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势
图像特征：取样
>>如果在取样过程中像素数太少，那么，所有组成样品的空间细节 将在图像中无法表示出来。
>>如果取样像素数过多，那么也不能得到额外的空间信息，这时认 为对样品过取样。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
缩放因子
优点：不需要更换物镜，而通过改变激光扫描的区 域来实现采用电子方式改变放大倍率
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
• 激光扫描共聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope ， LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产 品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器，有细胞“CT”之称。 • 激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用 共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有 一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。 • 与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时 观察并可形成清晰的三维图像等优点。所以它问世以来在形态学、分 子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等研究领域中得到了广泛 应用。
实际的样品不是点源，而是由无穷多的小于系统分辨率的物体组成的。
某一点的荧光团被激发后，

荧光团向空间各个方向发射荧光
部分荧光被聚焦，形成一个爱里 斑，中间亮，周围有明暗相间并 依次递减的图案。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
PSF (x,y,z)基于样品空间无限小的一点的光发射
当收集到样品三维图像时，就得到每一点的完整的点扩展函数。点扩展 函数描述了样品中每一点发出的光经过光学成像系统后的变化情况。
Wide-field Fluorescent Microscope
Confocal Microscope
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
• LSCM原理示意图
• Marvin Minsky (1950s) • 基本原理：相干光（激光）通过 与样品上扫描光点共轭（共焦） 面上的一个针孔； • 光束被DM反射到样品上，光点在 某一个焦面上沿着样品扫描； • 照明点发出的荧光 (同一焦面）通 过DM后被聚焦成一点，成像到探 测器前的共焦针孔上； • 焦面外的光不能到达PMT；
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
共焦显微扫描系统：
• • 样品台扫描----扫描光束静止，载有样品的样品台移动 光束扫描----样品静止，光束移动 1. 单光束 (cLSM): 速度慢 2. 多光束(旋转盘): 速度快（几乎实时)
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
• 序列数据采集 图像采集的速度
双光子荧光显微成像 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光 子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理：在高光子密度的情况下，荧光分 子同时(10-16s)吸收两个长波长的光子，在经过一个很短的 所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子。
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5.5 多光子激发荧光显微技术
www.olympusfluoview.com
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
共聚焦光 学切片3D 重构图
3D共焦与全场 显微图比较
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
共聚焦显微镜的优点
• • • • • • • 减少由于焦面外光散射产生的图像模糊（背景消除） 增加有效分辨率 控制景深，提高信噪比 厚样品光学切片的序列采集（Z轴切片扫描3D重建） 可以实现数字放大倍率的调节 活体样品成像 多色标记
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5.5 多光子激发荧光显微技术
双光子荧光显微装臵
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5.5 多光子激发荧光显微技术
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5.5 多光子激发荧光显微技术
解扫探测，Descanned Detection (DDD) 扫描光路
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非解扫探测，Non-Descanned Detection (NDD)
5.5 多光子激发荧光显微技术
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
图像特征：将连续图像变成数字形式
图像
• 离散阵列 • 关于亮度或色调的详细信息 • 精确的位置信息，详细的数值信息
包含强度信息的小的 矩形块组成的两维阵 列-->>像素
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
图像特征：将连续图像变成数字形式 为了将连续图像转变成数字形式，采用两个分别被称为 取样和量化的过程，将模拟图像被分成独立的亮度值 。
全场显微镜
•同时获取整个图像 •更适用于活细胞或运动细 胞
共焦显微镜
•逐个照明各个区域，直至整 个视野被取样--->图像采集 速度慢
•活细胞，运动细胞->>Nipkow disk-type system
与计算机图像存贮技术兼容，在细胞或组织内产生高空间分辨数 字化数据集，反映标记物的三维分布，或细胞的层析成像。
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5.5 多光子激发荧光显微技术
多光子的缺点（与共焦相比） 操作复杂 系统昂贵

多光子的优点： 减小光谱串扰； 不用共焦针孔实现固有的三维分辨； 长波长光成像深度深； 不采用UV光学器件对UV染料成像； 34 在焦点外区域的光漂白和光损伤小。
5.5 多光子激发荧光显微技术
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
序列数据采集：逐点构建图像
• 目的是用尽可能小的聚焦光点在焦面上照明样品。
将准直的平面波从后方送入物镜，被物镜变成汇聚的球面波，形成 衍射受限激发光点。 这样，利用了物镜的最大数值孔径NA，将光聚焦成非常小的光点。
• 照明光点沿着样品做两维栅扫描，将照明点的光信号按照 对应位置和亮度显示在监视器上。 • 逐点构成样品的图像。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
花粉粒的3-D重建
尽管只显示了序列采集的36幅图像中的12幅，但是这些图像代表了相距 为大约3μm的不同焦面，显示了花粉颗粒内部结构。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
全场成像和共聚焦
全场成像
共聚焦
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Fra Baidu bibliotek.4 激光扫描共聚焦显微技术
图像特征：点扩展函数 （PSF 和爱里斑）
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
光束扫描
聚焦光束在样品表面做横向的 (x-y平面)栅扫描，利用检流计 马达驱动两面镜子的振动来进行光束扫描，产生扫描图案。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
2D 图像：x-y扫描
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
光学切片：Z切片和样品的3-D重建
在共焦图像中没有非焦面的光的干扰，因此可以对完整的 固定或活体样品进行直接的非侵入序列光学切片观察--->> 对透明样品如细胞和组织进行3-D成像。
双光子荧光显微成像
光源要求：
双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光 子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的 激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度 只有 ~100 fs，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜 的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜 的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了 荧光检测效率。
光漂白
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5.5 多光子激发荧光显微技术
吸收截面大，Stokes红移大
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5.5 多光子激发荧光显微技术
活体神经元细胞双光子成像
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5.5 多光子激发荧光显微技术
MPFM应用
老鼠肾脏细胞的多通道双光子荧光图像
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5.5 多光子激发荧光显微技术
MPFM应用
Gutiérrez-Alcalá G et al. PNAS 2000;97:11108-11113
主要有单光子荧光成像和双光子荧光成像。
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5.5 多光子激发荧光显微技术
单光子荧光显微成像 单光子激发中，荧光分子每吸收一个照明光子，从基 态跃迁到激发态，经过能量弛豫后释放一个波长比激 发光子波长长的荧光光子。单光子荧光在深层组织细 胞会发生光子扩散，导致图像背景模糊不清。
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5.5 多光子激发荧光显微技术
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5.5 多光子激发荧光显微技术 荧光显微成像
原理：激发荧光本质上是受激吸收和自发辐射的过程， 组织吸收高能量的光子，电子跃迁到激发态，然后跃迁 回低能态（不一定是基态，有可能是较低能量水平的激 发态），并自发辐射光子（荧光）。
荧光显微像信噪比高，能够区分非常低浓度的生色团的 空间分布。
逐点重构图像
• 光学切片 • 图像特征
x-y扫描和z切片 缩放因子 点扩展函数 (PSF)
动态范围
• 应用
3D-图像重建 4D-时序成像
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
序列数据采集：图像采集速度
‘扫描’意味着每一层的图像通过序列取样来进行构建，用移动光束扫描 样品，与全场方法相比有一些缺点：
参考资料：高分辨率激光共焦显微成像技术新进展 http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120302/3897023/
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本章内容
5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
Arc Lamp Excitation Diaphragm Excitation Filter Ocular PMT Laser
Excitation Pinhole
Excitation Filter
Objective
Objective
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
• PMT将聚焦光转换成模拟电信号 （电压不同代表强度不同）；
• 通过移动显微镜的样品台，可以 对不同的焦面进行扫描。
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术 • Marvin Minsky’s patent picture
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5.4 激光扫描共聚焦显微技术
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LSCM光路
5.4 激光扫描共聚焦显微技术
• 全场显微图(a,b,c) • 共焦显微图(d,e,f)，
比较单光子荧光和双光子荧光：
1）在单光子激发状态下，发射波长大于激发波长，荧光发 射率与激发强度成正比，结果荧光在整个激发路径上产生。
2）在双光子激发过程中，利用波长更长的激发光激发，荧 光由同时吸收的两个光子产生，这样荧光强度与激发光强度 的平方成比例。 3）单光子激发只适用于对样品表面进行成像; 双光子激发能 够对样品表面以下几百微米的深度进行成像。