低温对植物的伤害

低温对植物的伤害

实验原理

植物在遭受低温伤害后，植物原生质膜，选择性丧失，对物质的透性发生改变，使得一些盐类，或有机物从细胞中渗出，进入周围溶液中，通过电导度的测量和糖的显色反应，即可见到外界溶液中电介质和糖类的增加。

材料、仪器与试剂：

植物材料：植物叶子

仪器：电导率仪、火焰光度计、冰箱、小烧杯、钻孔器、大试管、水浴锅、移液管。

试剂：蒽酮、浓H2SO4 。

方法与步骤：

1.取植物叶片置于冰箱内，放置2、4、6小时或更长时间，取出用直径约1cm的钻孔器，钻取叶子圆片40片，用蒸馏水洗3遍，以除去切口汁液，置于盛有20ml蒸馏水的小烧杯中。另取未经低温处理的叶片，，同样钻取40个圆片，洗涤后，置于另一盛有20ml蒸馏水的小烧杯种，置于室温中让其浸泡数小时（两小时以上）。

2. 叶片浸液含糖量的测定：除上述烧杯中的叶子圆片，吸取浸出液1ml 于大试管中，加蒽酮少许及少量浓H2SO4 ，摇匀，于沸水中煮10分钟，如有糖存在，可产生绿色，绿色深浅，即表示糖分的多少。

3. 叶片浸液电导率的测定：将余下的浸出液用电导仪测量溶液

的电导度，电导度越大则溶液中的电解质含量越高。

4.将渗出液用火焰光度计测渗出液中的K+或其它离子浓度。比较含量的差别。

思考题：

1．比较经低温处理和未经低温处理的叶子，电导率、糖量及渗出液离子含量有何不同？

2. 还有那些其它方法可以测量植物遭受低温伤害的程度？有何实践意义？

呼吸速率的测定—广口瓶法

实验目的

?呼吸速率是植物生命活动强弱的重要指标之一，常用于植物生理研究及农业生产实践等方面。测定呼吸速率的方法虽然很多，但不外乎测定二氧化碳的释放量和氧气的吸收量两类方法。本实验用广口瓶法测定植物的呼吸速率，并比较小麦吸胀的种子与幼苗的呼吸速率。

实验原理

?密闭容器中加入一定量碱液（一般用氢氧化钡），并悬挂植物材料，则植物材料呼吸放出的二氧化碳可为容器中氢氧化钡所吸收，然后用草酸滴定剩余的氢氧化钡，从空白和样品二者消耗的草酸溶液之差，可计算出呼吸释放的二氧化碳量，其反应式如下：

Ba(OH)2+CO2→BaCO3↓+H2O

Ba(OH)2+H2C2O4→BaC2O4↓+2H2O

材料、仪器与试剂

?植物材料：吸胀小麦种、芽长0.5cm左右的小麦种子

?仪器：广口瓶装置（见图2）、台秤、酸式滴定管、滴定管架一套?试剂：1/44 mol/L草酸溶液：准确称取重结晶H2C2O4 ?2H2O 2.8651g，溶于蒸馏水中，定容至1000ml，每ml相当于1mg CO2。

?0.05mol/L 氢氧化钡溶液：Ba(OH)2 8.6g 或Ba(OH)2 ?8H2O 15.78g溶于1000ml蒸馏水中。如有浑浊待溶液澄清后使用。

?酚酞指示剂：称取1g酚酞，溶于100ml95%乙醇中贮于滴瓶中。

实验步骤

1.取500ml广口瓶两只，装置如图所示。瓶口加一三孔橡皮塞：一孔插入装有碱

石灰的干燥管,以吸收进入瓶内空气中的二氧化碳；一孔插入温度计；第三孔供滴定用，实验时插一小橡皮塞，塞下悬挂一尼龙纱小筐供装植物材料用。

2.空白滴定：拔出两广口瓶的小橡皮塞，向瓶中加入氢氧化钡溶液20ml，再塞进

瓶塞。充分摇动广口瓶几分钟，待瓶内二氧化碳全部被吸收后，拔出小橡皮塞，加入三滴酚酞，把酸滴定管插入孔中用草酸溶液进行滴定至红色刚刚消失为止，记下草酸溶液用量（ml）,即为空白滴定值。

3.材料滴定值的测定：倒出废液，先用自来水，再用煮沸并冷却过的蒸馏水洗净广口瓶，重加20ml氢氧化钡溶液于两广口瓶中。取吸胀小麦种100粒同时称出重量装入小筐中，迅速挂于橡皮塞下，塞好塞子。另一瓶取100粒芽长0.5cm左右的小麦种子，同时称出重量装入小筐中，操作同前。开始记录时间，其间轻轻摇动数次有利于二氧化碳充分吸收，经30分钟后迅速打开瓶塞取出小筐，立即塞紧。拔出小橡皮塞，加入三滴酚酞，用草酸滴定同前，记录草酸溶液用量，即为材料滴定值。

4.计算呼吸速率：

水势的测定

实验目的

?水是原生质的主要组成成分，占原生质总量的70%~90%。植物水分状况对植物生理的生理活动具有重要影响。植物水势是植物的水分状况的重要指标，对于植物水分生理的科学研究以及农业生产实践具有重要指导意义。

?水势是指偏摩尔体积水的化学势，规定纯水的水势为零，水分总是从水势高处流向水势低处，根据这一原理，可以用小液流法、露点微伏压计法等测定植物组织的水势。

小液流法

?实验原理

–将植物材料切成小块，浸泡在不同浓度的蔗糖溶液中，由于植物材料与蔗糖溶液间水势梯度的存在，导致蔗糖溶液从植物材料中吸水、失水或保持动态平衡，从而使蔗糖溶液变稀、变浓或保持浓度不变；由此可以找到与植物材料水势相当的蔗糖溶液浓度。算出植物组织的水势。

?实验材料与试剂

–中试管；

–青霉素小瓶；

–弯头毛细吸管；

–单面刀片；

–打孔器；

–解剖针；

–移液管；

–镊子；

–蔗糖；

–甲基兰

?实验步骤

–配制一系列不同浓度的蔗糖溶液，浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6M。

–取6只中试管编号，分别加入10ml不同浓度的蔗糖溶液；同时取6个青霉素小瓶，编号后分别加入1ml不同浓度的蔗糖溶液。

–取植物材料，用打孔器打成直径0.7cm左右的小条，用单面刀片切成2~3mm 厚的小圆周片，分别加入装有不同浓度蔗糖溶液的青霉素小瓶中，每个小瓶中放5片(依植物材料的不同可做不同处理)，加塞，放置30min，其间摇动数次以加速溶液与植物组织间的水分交换。

–打开瓶塞，用解剖针向每个小瓶中挑入少许甲基兰，摇匀，使溶液呈蓝色。

–用毛细吸管依次从青霉素小瓶中吸取少量溶液，小心插入装有相同浓度蔗糖的中试管的中部，轻轻挤出吸管中的蓝色液体，

观察记录小液流的方向。

?实验结果

?结果分析

–如果小液流上升，说明组织水势高于蔗糖溶液水势，组织排水，蔗糖浓度变低；如果小液流下降，说明组织水势低于蔗糖溶液水势，组织吸水，蔗糖浓度变大；如果小液流不动，说明组织水势与蔗糖溶液水势相同，二者间无水分量的交换。

表：蔗糖溶液浓度与其渗透势

?注意

1．蔗糖溶液用前一定要摇匀，时间放久了的蔗糖溶液会分层，影响结果。

2．弯头毛细吸管要各个浓度专用

叶绿素a与叶绿素b含量的测定

实验目的和意义

?叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

实验原理

?叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。

?A663=82.04Ca+9.27Cb（1）

?A645=16.75Ca+45.60Cb（2）

?公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。即混合液在某一波长下的光吸收等于各组分在此波长下的光吸收之和。

将上式整理，可以得到下式：

Ca=0.0127A663-0.00269A645（3）

Cb=0.0229A645-0.00468A663（4）

将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：

Ca=12.7A663-2.69A645（5）

Cb=22.9A645-4.68A663（6）

CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）

CT为叶绿素的总浓度

实验仪器及材料

?实验材料：

–菠菜或其它绿色植物

?实验仪器及试剂：

–UV-1700 分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；丙酮；石英砂；CaCO3；

实验步骤

?提取叶绿素

选取有代表性的菠菜叶片数张，于天平上称取0.5g，（也可用打孔器打取一定数量的叶圆片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入5ml 80%丙酮，

少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀浆，用滤斗过滤到10ml量筒中，注意

在研钵中加入少量80%丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量筒内，

并定容至10ml。将量筒内的提取液混匀，用移液管小心抽取5ml转入25ml

量筒中，再加入80%丙酮定容至25ml（最终植物材料与提取液的比例为W：V＝0.5：50＝1：100，叶色深的植物材料比例要稀释到1：200）。

?测量光吸收

利用722分光光度计或UV1700分光光度计，分别测定叶绿素提取液在645nm和663nm下的吸光度。

结果分析

将测得的数值代入到公式（5）（6）（7）中，计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。最后要计算出单位叶片鲜重中叶绿素的含量：

叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝Ca×50ml（总体积数）×1ml/1000ml/L ÷0.5g=0.1Ca

叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝0.1Cb

总叶绿素含量(mg/g鲜重)＝0.1CT

讨论：

1．叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰，为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量。

2．计算叶绿素a与叶绿素b含量的比值，可以得到什么结论？3．比较阳生植物和阴生植物的叶绿素a和叶绿素b的含量以及比例，可以得到什么结论？

叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定

实验原理

?叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。

?分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。纸层析是其中最简单的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。

材料、器材与试剂

?植物材料

–根据季节从市场上购买新鲜的菠菜，芹菜或油菜，选取其中之一新鲜绿叶作为实验材料。也可以从校园内采集其他植物新鲜绿叶。

?器材

–大试管（20*200）、台秤、研钵、剪刀、量筒、漏斗、分液漏斗、软木塞、烧杯、

–新华滤纸、小试管若干、分光计、酒精灯、吸耳球、移液管、电吹风、毛细管

?试剂

–95%乙醇、碳酸钙、石英砂、汽油、苯、KOH、甲醇、醋酸铜、盐酸

实验步骤

?叶绿体色素的提取与分离

①称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片（或其他植物叶）2g，剪碎放入研钵中，加入乙醇5ml、少许CaCO3(中和细胞中的酸防止Mg2+从叶绿素中心释放)和石英砂，研磨成匀浆，再加入适量的乙醇（5-10ml），然后用漏斗过滤，即得叶绿体色素液。

②取准备好的滤纸条（2*20cm）,将其一端剪去两侧，中间留一长约 1.5cm，宽约

0.5cm的窄条。

③用毛细管吸取叶绿体色素提取液点于滤纸的下端窄条的上方中央，注意下一次所点溶液不可过多，如色素过淡，用电吹风吹干后再重复1-2次。

④在大试管中加入汽油5-10ml(或其它层析液，如石油醚:丙酮:苯为20:2:1的混合溶液可作层析液)。然后滤纸条上端固定在软木塞上，插入试管内，使窄条进入溶液中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处（或试管外套一黑纸套）。

⑤经0.5-1h后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色的是胡萝卜素，其次为叶黄素，于下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b.

?叶绿体色素的理化性质

①叶绿素的荧光现象：

取叶绿体色素提取液少许于1 支试管中，用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。

②光对叶绿素的破坏作用：

取叶绿体色素提取液少许，分装两支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸套包裹），另一支放在强光下（阳光下），经过2-3h 后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？

③黄色素（胡萝卜素和叶黄素）与绿色素（叶绿素）的分离：

取叶绿体色素提取液5ml,加到盛有2ml KOH甲醇溶液的分液漏斗中，摇动分液漏斗，加入1mlDW，再加入5ml苯，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。上层是黄色素，下层是绿色素，分别保存于试管中。

④观察色素溶液的吸收光谱：

a. 调节分光计，观察日光的光谱。

b. 观察下层绿色部分的吸收光谱

c. 观察上层黄色部分的吸收光谱。

植物光合速率的测定

目的意义

?光合作用是植物体内最为重要的同化过程，光合速率的测量是研究植物的光合性能、诊断植物光合机构的运转、研究环境因素对光合作用的影响的重要方法。

测定方法

根据光合作用的方程式：

H2O+CO2CH2O+O2

测定方法可分为三大类

–测定干重的增加（半叶法、改良半叶法）

–测定氧的释放（叶园片氧电极法）

–测定CO2的吸收（气流法）

?在这三种方法中，方法（1）过于粗糙，误差轻大而可靠性差，且过于耗时，仅可用于验证性实验；方法（2）通过测定液体中的含氧量的连续变化来测定光合速率，可在液体中加入各种试剂来测定其对氧释放的影响，并可用于研究藻类植物的光合速率，具有较高的灵敏度，适应于实验室中使用；方法（3）通过直接测定活体叶片的CO2交换，可以迅速准确地测出光合速率，近年来便携式光合作用系统的出现，使之可以广泛地用于田间和实验室。同时通过内置或外接计算机改变叶室的光强、CO2浓度、湿度，还可以非常迅速方便地测定植物的CO2补偿点、CO2饱和点、光补偿点、光饱和点、植物的羧化效率、表观光合量子效率、蒸腾速率等指标。在研究逆境生理、生态生理中得到了广泛地利用。

气流法

?设备：红外气体分析仪———IRGA（infra red gas analyzer）?原理：任何具非对称性的气体分子，都有红外吸收，如CO2、H2O、NO2、SO2等，在一定浓度内，其红外吸收与其浓度成线性关系，由此可根据其红外吸收量测出其浓度。

CIRAS－2便携式光合作用系统

系统主要组成

?叶室：可调节光强（0~2000umol photons m-2S-1);调节温度（±10℃）；

调节叶面积

?主机：

–气路

–吸收管

–IRGA：4个，分别测定参比室与叶室的CO2与H2O的浓度，范围0~9999ppm –CO2调节器：可提供稳定的CO2，范围0~2000ppm

–电池

气路设计原理简易图

测量参数

?可测量叶室、参比室的CO2、H2O浓度、温度、湿度、气压、光合速率、蒸腾速率、气孔导度、叶肉细胞间隙CO2浓度等数十个指标。

?可由此测得植物的光合速率、蒸腾速率、呼吸速率、CO2补偿点、饱和点、光补偿点、饱和点、羧化效率、表观光合量子效率等多种参数

简要使用说明

?实验前的准备：

–主机电池充电、光源蓄电池充电、掌上电脑充电

–CO2吸附剂（Ca(OH)2）、吸水剂（CaCl2）的检查与更换

实验材料

?玉米或其它植物，将玉米种子充分吸涨后播种于细砂中，出苗后浇以Hoagland培养液，长至5叶期时可用于做实验。

?实验步骤

–主机与叶室连接

–如需CO2调节器则安装CO2调节器

–如需人工光源则安装光源及光源蓄电池

–打开光合仪主机电源

–打开电脑，进入Ciras控制功能

–Ciras登陆

–进入操作界面，进行系统设置，设定叶室参数，进行各项测定，记录结果。

–关闭系统

关闭Ciras系统、Ciras电源、关闭光源、光源电源、关闭电脑

结果输出：

?测定的结果储存于掌上电脑中，可以通过Active Sync通讯软件将掌上电脑连到台式机中，将结果输出到台式机中，用Excel软件对结果进行分析，并可打印出来。

结果分析

注意事项

1. 在田间测定时，供给叶室的空气须取自2米以上的空中，并离开人群5米以外，以防止CO2浓度的波动。而在室内测定时，空气须来自室外，或最好利用压缩气体钢瓶提供CO2，利用CO2控制器控制CO2浓度。2．在测定植物的光合速率前须对植物进行光适应，使其气孔处于开放状态。

3．实验后须松开叶室，使叶室密封垫恢复正常状态。

植物灰分元素的分析

实验目的

?植物体内含有大量矿质元素，通过对植物体内矿质元素的分析，可以了解植物对矿质元素的吸收和利用，有助于制定合理施肥计划。

?本实验练习定性测定植物组织内的矿质元素。

实验原理

1：获得矿质元素

新鲜材料水分以气态跑掉

2：分析矿质元素

通常利用灰分元素与特殊试剂的专一性反应，能够产生一定形状的晶体和颜色，就可以在显微镜下作定性鉴定。

设备与材料

?显微镜

?马伏炉

?玻璃棒

?载玻片

?盖玻片

?白磁板

?黑磁板

?烘箱

?台称

?1%盐酸

?1%硫酸

?1%氨水

?1%磷酸氢二钠

?1%硝酸锶

?1%黄血盐

?1%KCl

?植物叶片

实验步骤

?植物材料的灰化

–称取50g新鲜叶片，用自来水冲净后用蒸馏水冲洗2次，放入玻璃容器中置于100~105℃烘箱中约30~ 60min，然后放于坩埚中于550 ℃约6小时灰化至白色。

?灰分溶液的准备

–少量灰分溶解于1－2ml蒸馏水中，用于鉴定氯元素。

–少量灰分溶解于3－4ml 10%HCl中，用于鉴定其它元素。

?灰分元素的鉴定

–氯

取干净黑磁板，加上一滴灰分元素溶液，再加入一滴1%AgNO3，看生成的AgNO3沉淀。

–钾

取灰分元素一滴加入干净载玻片上，再加上一滴钾试剂混合，盖上盖玻片，数分钟后，于显微镜下观察有无铅黑色的铅铜亚硝酸钾结晶，绘简图。

–钙

取灰分元素一滴加入干净载玻片上，再加上一滴1%硫酸混合，盖上盖玻片，数分钟后，于显微镜下观察石膏的针状结晶簇，绘简图。

?镁

取灰分元素一滴加入干净载玻片上，先用1滴1%氨水中和，再加上一滴1%磷酸氢二钠，生成磷酸镁氨盐，结晶有雪花、星星、箱子、屋顶等形状，绘简图。

?磷

取灰分元素一滴加入干净载玻片上，再加上一滴1%钼酸铵混合，产生黄绿色的磷钼酸铵结晶，且颜色逐渐变绿，绘简图

?硫

取灰分元素一滴加入干净载玻片上，再加上一滴1%硝酸锶，生成硫酸锶结晶，绘简图。

?铁

取灰分元素一滴加入干净白磁板上，再加上一滴黄血盐，生成兰色普鲁士兰。

实验结果

注意

?滴加灰分及试剂时滴管勿相互污染。

?加后放盖玻片

?由于结晶的形成需要时间，故须几分钟后观察。