黄酮混合物体外抗氧化活性的相互作用

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黄酮类化合物广泛存在于水果、蔬菜、谷物、植物来源的饮料(如红酒、绿茶等)等植物性食品中，具有保护心血管、降血压、降胆固醇、抗
收稿日期：2012-08-25
基金项目：宁波职业技术学院2011年院级课题(NZ11022)；宁波工程学院“北仑科技创新基金”项目。

作者简介：汤晓(1981—)，女，浙江宁波人，硕士研究生，讲师，研究方向为植物有效成分提取与应用。

癌、杀菌、消炎等多种生理活性[1]。

黄酮类化合物的基本结构为2个苯环通过中央三碳链连接而成，目前已确认结构的黄酮有5000多种，可划分为10
汤 晓1，焦泽武1，龚淑珍1，梁 春1，方振飞1，关亚璠1，仇 丹2
(1.宁波职业技术学院应用化工系，宁波 315800；2.宁波工程学院化学工程学院，宁波 315016)
摘要：测定槲皮素、异槲皮素、杨梅素、山萘酚、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等9种黄酮类化合物及其两两混合物的体外抗氧化活性，以研究黄酮混合物的协同、拮抗与加合作用。

以DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化性、还原能力为评价指标。

结果表明，含有较多B 环羟基的黄酮类化合物更易发生拮抗作用，可通过调节黄酮单品的比例减小混合物的拮抗作用或是增强其协同作用，不同反应机理的评价指标所得结果不同。

关键词：黄酮；抗氧化活性；协同；拮抗；加合
中图分类号：R 285 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0198-09
Interaction of flavonoids mixtures on antioxidant activities in vitro
TANG Xiao 1, JIAO Ze-wu 1, GONG Shu-zhen 1, LIANG Chun 1, FANG Zhen-fei 1, GUAN Ya-fan 1, QIU Dan 2
(1.Department of Chemical Engineering, Ningbo Polytechnic College, Ningbo 315800;2.College of Chemical Engineering, Ningbo University of Technology, Ningbo 315016)
Abstract: This study investigated in vitro antioxidant activities of quercetin, isoquercetrin, myricetin, kaempferol, catechin, epicatechin, apigenin, delphinidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-glucoside and their pairwise mixtures to evaluate synergistic, antagonistic, and additive effects of flavonoids mixtures. DPPH radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity, total antioxidant activity and reducing power were used as evaluation indicators. The results indicate that flavonoids with more B ring hydroxyls are more influenced by antagonistic effect. Antagonistic effect could be reduced and synergistic effect could be enhanced by changing the ratio of single flavonoid in the mixture. Different reaction mechanisms could induce different experimental results.
Key words: flavonoids; antioxidant activity; synergistic; antagonistic; additive
黄酮混合物体外抗氧化活性的相互
作用
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大类。

其中，黄酮醇类、黄酮类、花青素类、儿茶素类、黄烷醇类、异黄烷醇类等6大类黄酮在饮食中存在更为广泛[2]。

许多学者研究了植物性食品的抗氧化作用，并探讨了所含黄酮的结构与抗氧化活性的关系[3-4]。

研究亦表明，混合食品的抗氧化性可能呈现协同、拮抗或加合作用[6]。

也有研究发现，黄酮类化合物与某些维生素、β-胡萝卜素等天然抗氧化剂混合后，混合物的生理活性显著高于(协同)或低于(拮抗)抗氧化剂的个体之和[6-7]。

由此可见，黄酮等天然抗氧化剂对人体健康的促进作用取决于这些抗氧化剂个体之间的平衡。

黄酮类化合物的相互作用对于研究植物性食品对人体健康的保护作用或是对某些疾病的缓和作用而言是至关重要的。

相反，某些黄酮的过度摄入也可能会导致细胞毒性[8]。

因此，对黄酮混合物抗氧化活性相互作用的研究将为开发功能性食品，以及进一步设计含黄酮类抗氧化剂的补给膳食或强化膳食提供科学依据。

尽管目前对于黄酮类化合物体外抗氧化活性的研究已较为广泛，但是，对于黄酮间相互作用的研究仍然较少[9-11]，而且往往采用单个指标进行衡量。

由于反应机理不同，单一方法并不能确保对黄酮混合物抗氧化活性相互作用判断的准确性。

本研究选取槲皮素、异槲皮素、杨梅素、山萘酚、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等9种黄酮类化合物，以DPPH清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化性、还原能力为评价指标，探讨上述黄酮两两混合后，混合物抗氧化活性的变化。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂
UV759紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅：上海申胜生物技术有限公司。

槲皮素(批号110802)、异槲皮素(批号110927)、杨梅素(批号110922)、山萘酚(批号111013)、儿茶素(批号110927)、表儿茶素(批号110920)、芹菜素(批号111105)、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷(批号110829)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(批号111022)：色谱纯，纯度＞98%，上海融禾医药科技发展有限公司。

1.2 DPPH清除能力的测定[12]
取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。

分别取上述溶液1 mL，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液。

将反应液置于暗处，28 ℃反应20 min，于517 nm 处测定吸光度值，以不加样品为空白对照。

黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。

根据下式计算DPPH清除率：
DPPH清除率(%)=(1-A 样品/A 空白)×100结果以对DPPH的清除率达到50%的EC 50值(μg/mL)表示。

1.3 羟基自由基清除能力的测定[13]
取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。

在试管中依次加入1.5 mmol/L FeSO 4溶液1 mL，6 mmol/L H 2O 2 0.7 mL，20 mmol/L水杨酸钠溶液0.3 mL，再分别加入系列浓度的黄酮标准品溶液1 mL。

37 ℃水浴下反应1 h，以超纯水为参比，于562 nm处测定吸光度值。

黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。

根据下式计算羟基自由基清除率：
羟基自由基清除率(%)=[A 0-(A 1-A 2)]/A 0×100式中：A 0为空白对照的吸光度值(不加样品)； A 1为加入样品后的吸光度值； A 2为不加水杨酸钠的吸光度值。

结果以对羟基自由基的清除率达到50%的EC 50值(μg/mL)表示。

1.4 总抗氧化性的测定[14]
取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。

分别取上述溶液1 mL，加入1 mL反应试剂(0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L 磷酸钠以及4 mmol/L钼酸铵)。

试管加塞后，95 ℃水浴反应90 min。

冷却至25 ℃，测定695 nm处的吸光度值，以不加样品为空白对照。

黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。

1.5 还原能力的测定[15]
取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。

分别取上述溶液1 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.6) 以及2.5 mL 1% 铁氰化钾，充分混匀。

50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，2.5 mL去离子水以及0.5 mL 0.1%三氯化铁，于700 nm处测定吸
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光度值，以不加样品为空白对照。

黄酮标准品的两两合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。

1.6 数据分析
所有试验均重复3次，试验结果以平均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析2.1 DPPH清除能力
9种标准品对DPPH清除能力的顺序为：槲皮素>杨梅素>异槲皮素>表儿茶素>儿茶素>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷>飞燕草素-3-O-葡萄糖苷>芹菜素>山奈酚(表1)。

表1 黄酮单品及其混合物(1:1)自由基清除能力
样品EC 50/(μg/mL)DPPH 清除能力差异/%相互作用EC 50/(μg/mL)羟基自由基清除能力差异/%相互作用
槲皮素36.43±1.35--60.93±2.96--槲皮素+异槲皮素63.05±0.53-24.37±3.66拮抗76.88±2.50-23.05±7.79拮抗槲皮素+杨梅素79.22±4.56-65.51±10.72拮抗79.22±2.75-2.21±0.66加合槲皮素+山奈酚66.74±3.523.84±7.57协同51.50±4.8424.30±7.54协同槲皮素+儿茶素74.21±2.58-32.52±4.10拮抗65.50±6.25-7.94±3.46加合槲皮素+表儿茶素64.35±1.63-20.52±5.46拮抗101.42±1.87-59.44±6.92拮抗槲皮素+芹菜素
93.35±1.39-12.77±0.92拮抗73.01±1.46-0.83±0.13加合槲皮素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷83.72±1.45-30.18±4.52拮抗100.70±3.18-23.40±1.39拮抗槲皮素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
76.58±2.99-20.11±7.19
拮抗96.59±2.94-24.18±2.89
拮抗异槲皮素64.96±0.19--64.32±5.50--异槲皮素+杨梅素77.29±2.88-24.40±3.84拮抗91.99±2.77-16.22±5.53拮抗异槲皮素+山奈酚89.26±0.3112.40±2.66协同72.17±3.87-3.44±0.73加合异槲皮素+儿茶素82.05±5.14-16.76±7.91拮抗84.16±5.97-35.21±8.61拮抗异槲皮素+表儿茶素69.08±0.52-2.10±0.19加合62.63±1.50 4.17±0.93加合异槲皮素+芹菜素
94.38±5.34-2.75±0.12加合77.07±3.82-6.45±1.28加合异槲皮素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷95.04±5.34-20.95±5.56拮抗101.59±2.94-21.94±3.24拮抗异槲皮素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
97.71±8.63-25.22±8.55
拮抗106.15±4.96-33.62±7.84
拮抗杨梅素59.3±5.07--94.09±3.07--杨梅素+山奈酚85.77±5.1813.43±3.80协同83.67±1.24 1.14±0.36加合杨梅素+儿茶素84.48±1.24-25.27±3.35拮抗100.46±6.89-29.76±7.85拮抗杨梅素+表儿茶素78.12±5.07-20.51±4.00拮抗82.66±1.84-3.21±0.70加合杨梅素+芹菜素
114.29±0.32-21.31±3.26拮抗94.50±2.27-8.20±1.72加合杨梅素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷91.29±1.12-20.52±5.13拮抗85.90±0.7012.40±3.94协同杨梅素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
88.30±2.23-17.42±3.41
拮抗108.11±7.99
-14.68±2.64
加合山奈酚138.83±9.41--75.20--山奈酚+儿茶素101.48±2.47 5.34±0.20加合68.28±2.45-2.12±0.56加合山奈酚+表儿茶素97.42±5.22 6.86±1.11加合87.46±10.42-24.12±3.39拮抗山奈酚+芹菜素
122.24±13.478.76±3.15加合95.30±2.78-22.30±3.66拮抗山奈酚+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷97.67±1.6615.44±2.89协同87.50±2.54 1.37±0.42加合山奈酚+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
101.32±2.7711.86±2.07
协同82.51±3.61 2.87±0.80
加合儿茶素75.58±0.84--60.70±1.39--儿茶素+表儿茶素108.54±4.32-48.75±6.78拮抗80.06±2.87-26.08±6.64拮抗儿茶素+芹菜素
94.63±2.377.55±2.39加合79.50±4.15-12.45±5.07拮抗儿茶素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷97.78±4.74-16.57±6.83拮抗96.80±1.53-18.88±5.76拮抗儿茶素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
91.64±0.36-9.96±2.91
加合117.21±4.07-50.92±4.92
拮抗表儿茶素70.35±0.27--66.40±4.94--表儿茶素+芹菜素
65.81±2.5434.02±2.15协同84.65±4.54-15.07±2.83拮抗表儿茶素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷85.59±4.84-10.62±2.11加合94.89±5.28-12.55±2.56加合表儿茶素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
86.19±3.34-6.77±2.45
加合86.62±12.39-8.30±2.23
加合芹菜素
129.13±11.36
--80.66±0.59
--
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尽管槲皮素、杨梅素、异槲皮素具有较高DPPH清除能力，但当它们1:1混合后，混合物DPPH清除能力却被显著抑制，呈拮抗作用(P<0.05)，其中，槲皮素与杨梅素混合物与理论加和值的差异达65.51%。

当上述3种黄酮与表儿茶素、儿茶素、芹菜素以及两种花青素苷1:1混合后，混合物DPPH清除能力也均低于理论加和值。

异槲皮素与表儿茶素、芹菜素混合物与理论加和值的差异并不显著，呈加合作用(P>0.05)。

尽管山奈酚的DPPH清除能力低于其他黄酮，
但当它与其他黄酮1:1混合后，混合物DPPH清除能力与理论加和值相比却有不同程度提高。

其中，山奈酚与槲皮素、异槲皮素、杨梅素以及2种花青素苷1:1混合物的DPPH清除能力均显著增强，呈协同作用(P<0.05)，而山奈酚与槲皮素混合物与理论加和值的差异达23.84%，该混合物DPPH 清除能力仅次于槲皮素、杨梅素。

表儿茶素、儿茶素、芹菜素以及两种花青素苷1:1混合时，混合物DPPH清除能力也多低于理论加和值，但表儿茶素与芹菜素混合物却呈协同
芹菜素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷117.81±11.01-6.46±0.64加合101.91±1.65-11.52±2.37拮抗芹菜素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
109.27±8.320.76±0.11
加合123.59±5.78-40.95±4.33
拮抗飞燕草素-3-O-葡萄糖苷92.19±0.03--102.33±6.72
-
-飞燕草素-3-O-葡萄糖苷+矢车菊素
-3-O-葡萄糖苷
103.74±0.71-13.20±2.38
拮抗111.810±8.94-13.42±3.34拮抗矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
91.09±0.14
-
-
94.64±3.62
-
-
注：自由基清除能力差异(%)=100-[混合物EC 50×200]/(A EC 50+B EC 50) ：A EC 50、B EC 50分别为两种黄酮的EC 50值。

P<0.05，呈协同作用(混合物抗氧化性显著高于理论加和值)或拮抗作用(混合物抗氧化性显著低于与理论加和值)；P>0.05，呈加合作用(混合物抗氧化性与理论加和值相比无显著差异)。

续表
表2 不同比例黄酮混合物DPPH清除能力差异 %
样品比例3:12:11:11:21:3槲皮素+异槲皮素
-6.08±1.18
-8.04±1.30
-24.37±3.66
-33.04±3.85
-34.23±3.56
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗槲皮素+表儿茶素
11.23±2.53-0.42±0.04
-20.52±5.46
-12.46±5.32
-34.95±1.2
相互作用协同加合拮抗拮抗拮抗表儿茶素+芹菜素
46.52±1.5729.26±0.8434.02±2.1523.17±1.8912.39±0.83相互作用协同协同协同协同协同槲皮素+山萘酚-9.75±4.11
2.14±0.662
3.84±7.570.61±0.13 1.65±0.53相互作用加合加合协同加合加合槲皮素+儿茶素-
4.55±0.82
-12.17±1.83
-32.52±4.10
-27.94±3.04
-33.91±3.09
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗槲皮素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
-7.32±2.12
-9.19±2.33
-20.11±7.19
-26.69±1.32
-29.42±3.46
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗异槲皮素+杨梅素
-85.13±13.83
-41.42±7.41
-24.40±3.84
-31.39±8.81
-10.11±1.08
相互作用拮抗拮抗拮抗拮抗加合杨梅素+表儿茶素
8.18±3.770.70±0.08-20.51±4.00
-36.87±5.81
-42.40±8.35
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗槲皮素+杨梅素-36.92±10.38
-47.28±2.79
-65.51±10.72
-72.00±16.05
-75.36±13.45
相互作用
拮抗
拮抗
拮抗
拮抗
拮抗
注：自由基清除能力差异(%)=100-[混合物EC50×100×(a+b)]/(a×A EC50+b×B EC 50)：A EC 50、B EC 50分别为2种黄酮的EC 50值，a、b分别为2种黄酮在混合物中所占比例。

P<0.05，呈协同作用或拮抗作用；P>0.05，呈加合作用。

作用。

为进一步探讨黄酮间相互作用对DPPH清除能力的影响，选取具有较高DPPH清除能力的黄酮混合物，调整相互比例(表2)。

在槲皮素与异槲皮素、表儿茶、儿茶素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物中，提高非槲皮素的比例，拮抗作用比1:1
时进一步增大；提高槲皮素比例，混合物与理论加和值的差异却并不显著(P>0.05)，其中，槲皮素与表儿茶素在3:1时，呈协同作用。

槲皮素与杨梅素、表儿茶素与芹菜素混合物在各比例下分别均呈拮抗作用与协同作用，提高杨梅素、表儿茶素比例，拮抗作用、协同作用更加显著。

槲皮素与
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山奈酚混合物，仅在1:1时呈协同作用，其他比例的DPPH清除能力与理论加和值相比无显著差异(P>0.05)。

在杨梅素与异槲皮素、表儿茶素混合物中，降低异槲皮素、表儿茶素比例，混合物与理论加和值相比无显著差异(P>0.05)。

2.2 羟基自由基清除能力
9种标准品对羟基自由基清除能力的顺序为：儿茶素>槲皮素>异槲皮素>表儿茶素>山奈酚>芹菜素>杨梅素>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷>飞燕草素-3-O-葡萄糖苷(表1)。

与DPPH清除能力不同的是，儿茶素、槲皮素、异槲皮素、表儿茶素的羟基自由基清除能力高于其他黄酮。

当它们1:1混合后，混合物羟基自由基清除能力多呈拮抗作用，其中，槲皮素与表儿茶素混合物与理论加和值的差异达59.44%。

当上述4种黄酮与芹菜素、杨梅素以及2种花青素苷1:1混合后，混合物羟基自由基清除能力也均低于理论加和值，且多呈拮抗作用。

当山奈酚与其他黄酮1:1混合后，仅有山奈酚与槲皮素混合物的羟基自由基清除能力呈协同
作用(与理论加和值的差异为24.30%)，且该混合物的羟基自由基清除能力为最高；而山奈酚与表儿茶素、芹菜素混合物则呈拮抗作用；山奈酚与其他黄酮的混合物与理论加和值的差异并不显著(P>0.05)。

芹菜素、杨梅素以及2种花青素苷1:1混合时，混合物羟基自由基清除能力与理论加和值相比受不同程度抑制，但杨梅素与飞燕草素-3-O-葡萄糖苷混合物则呈协同作用。

为进一步探讨黄酮间相互作用对羟基自由基清除能力的影响，选取具有较高羟基自由基清除能力的黄酮混合物，调整相互比例(表3)。

在槲皮素与山奈酚混合物中，提高山奈酚比例，协同作用与1:1时相比有所减小；提高槲皮素比例，混合物与理论加和值相比无显著差异(P>0.05)。

在槲皮素与异槲皮素、儿茶素与芹菜素混合物中，提高异槲皮素、芹菜素比例，拮抗作用比1:1时进一步增大；提高槲皮素比例，混合物与理论加和值的差异并不显著(P>0.05)。

儿茶素与表儿茶素混合物在各比例下均呈拮抗作用，提高表儿茶素比例，
表3 不同比例黄酮混合物羟基自由基清除能力差异 %
样品比例
3:12:11:11:21:3槲皮素+山萘酚 6.22±2.1910.04±3.2024.30±7.5414.36±5.2913.27±3.44相互作用加合加合协同协同协同槲皮素+异槲皮素
-1.33±0.08
-3.65±0.82
-23.05±7.79
-29.17±8.42
-31.86±6.49
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗儿茶素+芹菜素 1.18±0.14-3.33±0.32
-12.45±5.07
-18.77±4.59
-21.20±8.86
相互作用加合加合拮抗拮抗拮抗儿茶素+表儿茶素
-16.23±6.29
-22.38±2.14
-26.08±6.64
-48.33±7.99
-44.25±7.53
相互作用
拮抗
拮抗
拮抗
拮抗
拮抗
注：自由基清除能力差异(%)=100-[混合物EC 50×100×(a+b)]/(a×A EC 50+b×B EC 50) ：A EC50、B EC 50分别为2种黄酮的EC 50值，a、b分别为2种黄酮在混合物中所占比例。

P<0.05，呈协同作用或拮抗作用；P>0.05，呈加合作用。

该作用更加显著。

2.3 总抗氧化性
9种标准品总抗氧化性顺序为：表儿茶素>儿茶素>飞燕草素-3-O-葡萄糖苷>槲皮素>杨梅素>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷>异槲皮素>山奈酚>芹菜素(表4)。

与DPPH及羟基自由基清除能力不同的是，黄酮混合物的总抗氧化性有较多高于理论加和值。

在自由基清除试验中呈拮抗作用的异槲皮素与槲皮素、杨梅素，以及杨梅素与表儿茶素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物，在总抗氧化性试验中呈协同作用。

其中，异槲皮素与杨梅素混合物与
理论加和值的差异达66.85%。

但仍有一些黄酮混合物的总抗氧化性呈拮抗作用，其中，异槲皮素与儿茶素混合物与理论加和值的差异达64.32%，且总抗氧化性为最弱。

山奈酚与儿茶素、表儿茶素混合物也呈拮抗作用，这2种混合物在自由基清除试验中亦无协同作用。

为进一步探讨黄酮间相互作用对总抗氧化性的影响，选取具有较高总抗氧化性的黄酮混合物，调整相互比例(表5)。

表儿茶素与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物在各比例下均呈协同作用，增加表儿茶素比例，该作用更加显著。

在表儿茶素与杨梅素、芹菜素混合物中，增加表儿茶
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2013年 第38卷 第2期
表4 黄酮单品及其混合物(1:1)对金属离子的还原能力
样品吸光度值总抗氧化性差异/%相互作用
吸光度值还原能力差异/%相互作用
槲皮素0.185±0.002--0.227±0.015--槲皮素+异槲皮素0.208±0.00223.81±4.89协同0.195±0.00419.67±2.26协同槲皮素+杨梅素0.187±0.0018.84±0.72加合0.236±0.00417.02±1.63协同槲皮素+山奈酚0.180±0.00523.29±7.45协同0.158±0.002 5.09±1.24加合槲皮素+儿茶素0.200±0.005-30.79±4.07拮抗0.173±0.005-12.03±2.95拮抗槲皮素+表儿茶素0.287±0.012-44.84±1.45拮抗0.205±0.002-0.65±0.10加合槲皮素+芹菜素
0.146±0.004
0.69±0.22加合0.145±0.0039.82±1.53加合槲皮素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.136±0.008-37.0±52.99拮抗0.160±0.018-0.52±0.14加合槲皮素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.175±0.004
2.54±0.38
加合0.169±0.003 6.51±0.79
加合异槲皮素0.151±0.014--0.098±0.001--异槲皮素+杨梅素0.258±0.02766.85±10.28协同0.186±0.00335.19±0.59协同异槲皮素+山奈酚0.134±0.004 3.35±0.21加合0.116±0.02039.00±8.48协同异槲皮素+儿茶素0.095±0.004-64.32±1.59拮抗0.121±0.024-6.94±0.87加合异槲皮素+表儿茶素0.367±0.005 5.86±0.67加合0.197±0.01838.50±8.67协同异槲皮素+芹菜素
0.142±0.004
10.39±1.85加合0.089±0.00829.41±1.96协同异槲皮素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.169±0.004-15.00±4.17拮抗0.116±0.00922.20±6.54加合异槲皮素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.118±0.009
-23.59±4.93
拮抗0.107±0.00915.19±3.22
协同杨梅素0.158±0.001--0.176±0.003--杨梅素+山奈酚0.145±0.0169.16±1.31加合0.117±0.001-6.38±0.93加合杨梅素+儿茶素0.290±0.029 5.33±1.90加合0.202±0.01519.96±8.59协同杨梅素+表儿茶素0.430±0.03122.78±10.55协同0.233±0.01828.43±7.90协同杨梅素+芹菜素
0.126±0.002
-4.68±0.76加合0.089±0.004-16.51±2.12拮抗杨梅素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.143±0.007-29.49±3.72拮抗0.138±0.001 1.60±0.25加合杨梅素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.191±0.010
21.48±6.17
协同0.151±0.00413.00±5.38
协同山奈酚0.107±0.010--0.074±0.009--山奈酚+儿茶素0.181±0.006-27.55±1.44拮抗0.119±0.015-2.27±0.34加合山奈酚+表儿茶素0.272±0.008-16.21±1.97拮抗0.148±0.00314.10±3.43协同山奈酚+芹菜素
0.120±0.004
12.85±0.70协同0.064±0.00114.29±0.21协同山奈酚+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.237±0.002 6.98±1.97加合0.085±0.0030.20±0.03加合山奈酚+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.161±0.002
22.22±3.39
协同0.098±0.00419.43±3.52
协同儿茶素0.392±0.023--0.161±0.016--儿茶素+表儿茶素0.397±0.005-15.01±3.88拮抗0.162±0.003-6.35±0.92加合儿茶素+芹菜素
0.238±0.003
-4.35±0.42加合0.088±0.002-11.41±1.39加合儿茶素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.312±0.001-2.40±0.53加合0.122±0.034-4.55±0.49加合儿茶素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.270±0.005
-1.64±0.28
加合0.129±0.008 2.92±0.13
加合表儿茶素0.543±0.009--0.186±0.006--表儿茶素+芹菜素
0.382±0.014
17.80±4.27协同0.131±0.00317.31±5.71协同表儿茶素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.374±0.003-5.20±1.42加合0.150±0.0057.00±1.25加合表儿茶素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.450±0.020
28.79±7.23
协同0.155±0.00812.56±3.31
协同芹菜素
0.105±0.004
--0.038±0.003--芹菜素+飞燕草素-3-O-葡萄糖苷0.166±0.010-5.40±0.37加合0.061±0.005-8.27±0.42加合芹菜素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.128±0.005
-2.29±0.57
加合0.058±0.005-9.38±0.93
加合飞燕草素-3-O-葡萄糖苷
0.246±0.003
--0.095±0.005--飞燕草素-3-O-葡萄糖苷+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
0.117±0.007
-41.35±4.06
拮抗0.073±0.006-21.72±3.42
拮抗矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
0.157±0.002
--
0.090±0.009
--
注：总抗氧化性、还原能力差异(%)=100-[混合物吸光度值×200]/(A吸光度值+B吸光度值)：A、B为2种黄酮单品。

P<0.05，呈协同作用或拮抗作用；
P>0.05，呈加合作用。

· 204 ·
素比例，协同作用增大。

在表儿茶素与儿茶素混合物中，增加表儿茶素比例，拮抗作用减小。

2.4 还原能力
9种标准品还原能力顺序为：槲皮素>表儿茶素>杨梅素>儿茶素>异槲皮素>飞燕草素-3-O-葡萄糖苷>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷>山奈酚>芹菜素(表4)。

与总抗氧化性试验相同的是，多种黄酮混合物的还原能力高于理论加和值。

除槲皮素与儿茶素、杨梅素与芹菜素、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物呈拮抗作用外，其余呈协同作用或加合作用。

杨梅素与槲皮素、表儿茶素混合物的还原能力最强。

为进一步探讨黄酮间相互作用对还原能力
表5 不同比例黄酮混合物总抗氧化性差异 %
样品比例
3:12:11:11:21:3表儿茶素+矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
37.04±2.9631.87±1.4828.79±7.2319.75±2.2910.20±0.26相互作用协同协同协同协同协同杨梅素+表儿茶素
5.69±0.927.29±0.3922.78±4.5520.86±1.3034.30±2.08相互作用加合加合协同协同协同儿茶素+表儿茶素
-23.75±2.39
-12.21±3.52
-15.01±3.88
-10.33±1.03
-2.59±0.24
相互作用拮抗拮抗拮抗拮抗加合表儿茶素+芹菜素
17.80±3.1215.66±1.7917.80±4.2711.37±1.617.77±1.51相互作用
协同
协同
协同
协同
加合
注：总抗氧化性差异(%)=100-[混合物吸光度值×100×(a+b)]/(a×A吸光度值+b×B吸光度值)：A、B为2种黄酮单品，a、b分别为2种黄酮在混合物中所占比例。

P<0.05，呈协同作用或拮抗作用；P>0.05，呈加合作用。

表6 不同比例黄酮混合物还原能力差异 %
样品比例
3:12:11:11:21:3槲皮素+杨梅素26.59±6.7827.81±4.3317.02±1.6314.43±1.9813.21±4.30相互作用协同协同协同协同协同杨梅素+表儿茶素
20.25±6.9927.57±5.8928.43±7.9032.35±9.9635.62±8.19相互作用协同协同协同协同协同杨梅素+儿茶素9.45±1.2013.39±3.4419.96±8.5914.69±5.2117.12±4.38相互作用加合协同协同协同协同异槲皮素+表儿茶素13.49±4.2118.14±2.1838.50±8.6732.29±6.3525.08±8.27相互作用
协同
协同
协同
协同
协同
注：还原能力差异(%)=100-[混合物吸光度值×100×(a+b)]/(a×A吸光度值+b×B吸光度值)：A、B为组成混合物的2种黄酮单品，a、b分别为2种黄酮在混合物中所占比例。

P<0.05，呈协同作用或拮抗作用；P>0.05，呈加合作用。

的影响，选取具有较高还原能力的黄酮混合物，调整相互比例(表6)。

杨梅素与槲皮素、表儿茶素混合物在各比例下均呈协同作用，增加槲皮素、表儿茶素比例，该作用更加明显。

杨梅素与儿茶素、异槲皮素与表儿茶素混合物在各比例下亦呈协同作用，但该作用在1:1比例时最为显著。

3 讨论
试验选取在食品中广泛存在、且具有较高抗氧化性的槲皮素、异槲皮素、杨梅素、山萘酚等黄酮醇类，儿茶素、表儿茶素等黄烷醇类，芹菜素等黄酮类，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊
素-3-O-葡萄糖苷等花青素类为研究对象。

评价指标包括自由基清除能力以及金属离子还原能力两方面。

DPPH法简便易行、灵敏可靠，羟基自由基测定采用 H 2O 2/Fe 2+体系，是一种经典的自由基测定方法。

研究表明，黄酮结构中，B环邻二羟基、2,3-双键与4-羰基、以及3,5-羟基是决定黄酮类化合物自由基清除活性的重要因素[3]。

因此，槲皮素、异槲皮素、杨梅素、表儿茶素、儿茶素等黄酮醇类及黄烷醇类呈现较高的自由基清除能力(表1)。

但是，当黄酮单品两两混合后，混合物的自由基清除能力却多呈拮抗作用。

在1:1混合物中，
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槲皮素与杨梅素、儿茶素与表儿茶素混合物DPPH 清除能力的拮抗作用最显著，而槲皮素与表儿茶素、儿茶素与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物羟基自由基清除能力的拮抗作用最明显，上述混合物与理论加和值的差异达50%或更高(表1)。

其他具有较多B环羟基的黄酮1:1混合后，拮抗作用也较为显著。

Abou Samra等人的研究表明，若2种黄酮均有3’,4’-二羟基结构，则混合物经反应后，由于2种黄酮均生成邻二苯醌结构，混合物抗氧化活性受到较强抑制[8]。

相反，若仅有一种黄酮的B环具有邻二羟基，则混合物抗氧化活性受到较小抑制，这可能是芹菜素、山萘酚与其他黄酮混合后，较少受拮抗作用，甚至呈协同作用的原因。

Choueiri 等人发现，槲皮素与儿茶素混合后易成为氧化强化剂，增强ROS作用，从而导致细胞毒性[16]。

Hidalgo等人认为，槲皮素、异槲皮素与花青素混合后，由于二者间发生氢键缔合，减少了羟基数目，降低了供电子能力，从而削弱了与DPPH的反应能力[11]。

此外，儿茶素、表儿茶素与具有4-羰基结构的黄酮混合后，儿茶素、表儿茶素的邻二酚羟基可与羰基发生氢键缔合，阻碍儿茶素、表儿茶素的供氢能力，从而降低黄酮混合物的抗氧化性[17]。

由此可见，含有较多B环羟基的黄酮类化合物，其混合物反应后由于缺少能够中断自由基链式反应的氢电子，DPPH以及羟基自由基清除能力更易受到抑制。

由于这些黄酮类化合物常共存于果蔬、红酒等植物性食品中，它们的相互反应会降低这些食品的抗氧化能力，因此，这种拮抗作用不可忽视。

当改变黄酮混合物中的单品比例，混合物的相互作用发生变化(表2、表3)。

若提高抗氧化性更强的黄酮单品比例，则可能减弱混合物的拮抗作用，或增强其协同作用。

除了自由基清除能力外，总抗氧化性、还原能力等基于对金属离子还原能力的测定亦是高度敏感、重现性好的评价指标，被广泛用于食品行业、抗氧化剂开发等领域[18]。

但是，依据金属离子还原能力对黄酮混合物体外抗氧化活性的评价，其结果与依据自由基清除能力并不完全相同。

槲皮素与异槲皮素、杨梅素，杨梅素与异槲皮素、儿茶素、表儿茶素等混合物的自由基清除能力呈拮抗作用，而金属离子还原能力则呈协同作用。

而槲皮素与表儿茶素、飞燕草素-3-O-葡
萄糖苷，儿茶素与异槲皮素、表儿茶素混合物在所有指标中均低于理论加和值，且多呈拮抗作用；山奈酚与槲皮素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷混合物在所有指标中均高于理论加和值，且多呈协同作用。

由此可见，对黄酮混合物体外抗氧化活性的研究应建立在多个评价指标之上。

在黄酮混合物中，若提高抗氧化性更强的黄酮单品比例，则同样可能减弱混合物的拮抗作用，或增强其协同作用(表5、表6)。

与试验结果不同的是，Rossetto等以抗亚油酸氧化为评价指标发现，儿茶素可促进矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等花青素的氢再生，从而提高混合物的抗氧化能力[10]；Pignatelli等人则通过人体质粒试验发现，儿茶素与槲皮素混合物能显著抑制血小板聚集，从而显著抑制胶原质引起的过氧化氢的产生[19]。

因此，对黄酮混合物体外抗氧化活性的评价取决于自由基的性质以及反应机理，而这些机理又受到黄酮羟基的数量与位置、甲基化基团、糖基化结构，以及反应试剂的结构与极性等因素影响。

此外，黄酮类化合物在体内的抗氧化活性并非直接来自对自由基的清除，某些黄酮可能通过对酶的转录活动而达到抗氧化效果[20]，因此，除了进行多指标评价外，也应进一步通过体内试验探究黄酮混合物抗氧化活性的生物反应。

4 结论
黄酮类化合物广泛存在于植物性食品中，具有某些特定结构的黄酮有较高抗氧化性。

但是，黄酮间的相互作用会影响混合物的抗氧化活性，这种相互作用与黄酮的结构以及反应机理、试剂特性等因素有关。

即使基于相同反应机理，结果仍可能有所不同。

含有较多B环羟基的黄酮类化合物，其混合物相比之下更易发生拮抗作用。

如果调整黄酮混合物中各单品比例，则可能减小拮抗作用或增强协同作用。

黄酮混合物体外抗氧化活性的相互作用，是指导合理膳食以及开发功能性食品的重要依据。

由于黄酮类化合物种类繁多，且对其相互作用的机理研究尚不十分明确，因此，更多种类黄酮的相互作用、2种以上黄酮混合后的抗氧化活性、黄酮混合物经抗氧化反应之后的结构，以及混合食品的抗氧化性等，都将是下一步的研究方向。