黄酮混合物体外抗氧化活性的相互作用

· 198 ·

黄酮类化合物广泛存在于水果、蔬菜、谷物、植物来源的饮料(如红酒、绿茶等)等植物性食品中，具有保护心血管、降血压、降胆固醇、抗

收稿日期：2012-08-25

基金项目：宁波职业技术学院2011年院级课题(NZ11022)；宁波工程学院“北仑科技创新基金”项目。作者简介：汤晓(1981—)，女，浙江宁波人，硕士研究生，讲师，研究方向为植物有效成分提取与应用。

癌、杀菌、消炎等多种生理活性[1]。黄酮类化合物的基本结构为2个苯环通过中央三碳链连接而成，目前已确认结构的黄酮有5000多种，可划分为10

汤 晓1，焦泽武1，龚淑珍1，梁 春1，方振飞1，关亚璠1，仇 丹2

(1.宁波职业技术学院应用化工系，宁波 315800；2.宁波工程学院化学工程学院，宁波 315016)

摘要：测定槲皮素、异槲皮素、杨梅素、山萘酚、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等9种黄酮类化合物及其两两混合物的体外抗氧化活性，以研究黄酮混合物的协同、拮抗与加合作用。以DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化性、还原能力为评价指标。结果表明，含有较多B 环羟基的黄酮类化合物更易发生拮抗作用，可通过调节黄酮单品的比例减小混合物的拮抗作用或是增强其协同作用，不同反应机理的评价指标所得结果不同。

关键词：黄酮；抗氧化活性；协同；拮抗；加合

中图分类号：R 285 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0198-09

Interaction of flavonoids mixtures on antioxidant activities in vitro

TANG Xiao 1, JIAO Ze-wu 1, GONG Shu-zhen 1, LIANG Chun 1, FANG Zhen-fei 1, GUAN Ya-fan 1, QIU Dan 2

(1.Department of Chemical Engineering, Ningbo Polytechnic College, Ningbo 315800;2.College of Chemical Engineering, Ningbo University of Technology, Ningbo 315016)

Abstract: This study investigated in vitro antioxidant activities of quercetin, isoquercetrin, myricetin, kaempferol, catechin, epicatechin, apigenin, delphinidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-glucoside and their pairwise mixtures to evaluate synergistic, antagonistic, and additive effects of flavonoids mixtures. DPPH radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity, total antioxidant activity and reducing power were used as evaluation indicators. The results indicate that flavonoids with more B ring hydroxyls are more influenced by antagonistic effect. Antagonistic effect could be reduced and synergistic effect could be enhanced by changing the ratio of single flavonoid in the mixture. Different reaction mechanisms could induce different experimental results.

Key words: flavonoids; antioxidant activity; synergistic; antagonistic; additive

黄酮混合物体外抗氧化活性的相互

作用

· 199 ·

2013年 第38卷 第2期

大类。其中，黄酮醇类、黄酮类、花青素类、儿茶素类、黄烷醇类、异黄烷醇类等6大类黄酮在饮食中存在更为广泛[2]。

许多学者研究了植物性食品的抗氧化作用，并探讨了所含黄酮的结构与抗氧化活性的关系[3-4]。研究亦表明，混合食品的抗氧化性可能呈现协同、拮抗或加合作用[6]。也有研究发现，黄酮类化合物与某些维生素、β-胡萝卜素等天然抗氧化剂混合后，混合物的生理活性显著高于(协同)或低于(拮抗)抗氧化剂的个体之和[6-7]。由此可见，黄酮等天然抗氧化剂对人体健康的促进作用取决于这些抗氧化剂个体之间的平衡。黄酮类化合物的相互作用对于研究植物性食品对人体健康的保护作用或是对某些疾病的缓和作用而言是至关重要的。相反，某些黄酮的过度摄入也可能会导致细胞毒性[8]。因此，对黄酮混合物抗氧化活性相互作用的研究将为开发功能性食品，以及进一步设计含黄酮类抗氧化剂的补给膳食或强化膳食提供科学依据。

尽管目前对于黄酮类化合物体外抗氧化活性的研究已较为广泛，但是，对于黄酮间相互作用的研究仍然较少[9-11]，而且往往采用单个指标进行衡量。由于反应机理不同，单一方法并不能确保对黄酮混合物抗氧化活性相互作用判断的准确性。本研究选取槲皮素、异槲皮素、杨梅素、山萘酚、儿茶素、表儿茶素、芹菜素、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等9种黄酮类化合物，以DPPH清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化性、还原能力为评价指标，探讨上述黄酮两两混合后，混合物抗氧化活性的变化。1 材料与方法1.1 仪器与试剂

UV759紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅：上海申胜生物技术有限公司。

槲皮素(批号110802)、异槲皮素(批号110927)、杨梅素(批号110922)、山萘酚(批号111013)、儿茶素(批号110927)、表儿茶素(批号110920)、芹菜素(批号111105)、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷(批号110829)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(批号111022)：色谱纯，纯度＞98%，上海融禾医药科技发展有限公司。

1.2 DPPH清除能力的测定[12]

取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。分别取上述溶液1 mL，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液。将反应液置于暗处，28 ℃反应20 min，于517 nm 处测定吸光度值，以不加样品为空白对照。黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。根据下式计算DPPH清除率：

DPPH清除率(%)=(1-A 样品/A 空白)×100结果以对DPPH的清除率达到50%的EC 50值(μg/mL)表示。

1.3 羟基自由基清除能力的测定[13]

取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。在试管中依次加入1.5 mmol/L FeSO 4溶液1 mL，6 mmol/L H 2O 2 0.7 mL，20 mmol/L水杨酸钠溶液0.3 mL，再分别加入系列浓度的黄酮标准品溶液1 mL。37 ℃水浴下反应1 h，以超纯水为参比，于562 nm处测定吸光度值。黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。根据下式计算羟基自由基清除率：

羟基自由基清除率(%)=[A 0-(A 1-A 2)]/A 0×100式中：A 0为空白对照的吸光度值(不加样品)； A 1为加入样品后的吸光度值； A 2为不加水杨酸钠的吸光度值。

结果以对羟基自由基的清除率达到50%的EC 50值(μg/mL)表示。1.4 总抗氧化性的测定[14]

取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。分别取上述溶液1 mL，加入1 mL反应试剂(0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L 磷酸钠以及4 mmol/L钼酸铵)。试管加塞后，95 ℃水浴反应90 min。冷却至25 ℃，测定695 nm处的吸光度值，以不加样品为空白对照。黄酮标准品的两两混合液，亦配制成相同浓度，分别取混合液1 mL，进行反应。1.5 还原能力的测定[15]

取一定量黄酮标准品，配制成系列浓度(25~100 μg/mL)的乙醇溶液。分别取上述溶液1 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.6) 以及2.5 mL 1% 铁氰化钾，充分混匀。50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，2.5 mL去离子水以及0.5 mL 0.1%三氯化铁，于700 nm处测定吸