木糖苷酶活性的测定方法

木糖苷酶活性的测定方法

β-木糖苷酶活性是由从底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷（pNPX，Sigma)释放出对硝基苯酚(pNP)的量来确定的。采用分光光度法[50]。测定体系总体积为800μL，反应体系为200μL，内含10μL20mmol/L底物pNPX、185μL 100mmol/L pH6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪哇缓冲液、5μL适量稀释粗酶液，于65℃反应5min,然后加入600μL1mol/L的Na2CO3溶液终止反应并显色，在405nm处测定光吸收值的增加量。一个酶活单位定义为在该反应条件下，lmin内催化产生1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量。用对硝基苯酚作标准曲线[51].

用对硝基苯酚(pNP)作标准曲线，具体方法:木糖苷酶对人工底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷（pNPX，Sigma)水解后的产物为对硝基苯酚(pNP)，碱性条件下它在405nm处有明显的光吸收值。配制浓度为1μmol/m1的对硝基苯酚，然后用不同体积的对硝基苯酚和水混匀，使二者总体积为200μL，最后用同样的1mol/L的Na2CO3终止显色，在405nln处测吸光值，pNP的量与A405成线性关系(图2-l)。