减毒活疫苗医学PPT课件

• 至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数 目、形态和结构检查;
• 至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，做出核 型分析;
• 粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率; • 每次染色体检查标本片应长期保存，以备复查;
如何筛选？
培养的单层细胞、接种病毒后
• 蚀斑法挑选（产生细导现胞致象细。病胞变的效萎缩应、的脱病落等毒病）变的
• 同一病毒：
– 蚀斑较大的：毒力相对强 – 蚀斑小的：毒力较弱
• 其减毒性在人体中必须是稳定的
• 减毒与免疫原性之间的平衡
– 减毒适度：保证人体使用安全 – 良好免疫原性：足以诱生特异性免疫应答
委托的单位保存、检定及分发。
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二、减毒活疫苗制备技术要求
菌、毒种的三级管理：定期全面检定
• 原始种子批
– 应验明其记录、历史、来源和生物学特性。
• 主种子批
– 从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保存的。
• 工作种子批
– 从主种子批制备，用于生产。
• 主种子批和工作种子批在规定代次内的生物学
特性应与原始种子批一致
3. 载体疫苗(vector vaccine)
• 利用非致病微生物作为载体、递呈外源抗 原的一种减毒疫苗。
• 将外源抗原的基因插入到载体微生物基因 组中，用这种表达外源抗原的微生物作为 疫苗。
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
载体疫苗(vector vaccine)
成本低 适于群体免疫
• 病毒载体疫苗
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第二节 减毒活疫苗设计与制备 的技术要求
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一、减毒活疫苗的设计要求
设计减毒活疫苗菌株或毒株，要根据生物制 品的用途、使用范围、使用方式、生产过 程和生产条件等因素来决定，设计时应注 意以下问题： – 安全性 – 免疫原性 – 遗传稳定性 – 生产适应性
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1.安全性
①残余毒力
– 残余毒力高：免疫原性：好 临床反应：大 – 残余毒力低：免疫原性：差 临床反应：小
– 痘苗病毒 – 腺病毒 – 麻疹病毒 – 脊髓灰质炎病毒等
• 细菌载体疫苗
– 产单核细胞李斯特菌
– 沙门菌
– 霍乱弧菌
– 志贺菌
– 卡介苗
– 小肠耶尔森菌
– 炭疽杆菌
– 戈登菌属
– 乳杆菌属
– 葡萄球菌属等
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五、减毒活疫苗研究面临的问题
1. 安全性
• 成功或比较成功的预防性疫苗
– 牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎、乙型 脑炎等减毒活疫苗
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
2. 遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine) • 反向遗传技术的发展，可以对分节段的RNA
病毒进行定向重配，提高重配效率。 • 研究热点：
• 甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活 疫苗株。
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
③纯化水和注射用水： 《中华人民共和国药典》 ④生产用器具:必须清洗干净、灭菌处理。 ⑤生产及检定用动物:
鸡胚细胞的来源鸡群：SPF级 提供肾脏的家兔、狲猴：隔离检疫合格 小鼠、地鼠、豚鼠：清洁级
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二、减毒活疫苗制备技术要求 2. 菌、毒种
• 国家药品管理局批准 • 由国家药品检定机构或国家药品管理局所
3. 载体疫苗研究中存在的问题 ①载体微生物蛋白的过量表达，严重干扰欲表达抗
原诱导机体免疫应答; ②非复制型载体微生物（如禽痘病毒）的减弱或消
失，导致目的抗原表达量降低，影响疫苗免疫原 性; ③目的抗原微生物和载体微生物感染途径不一定相 同，而致使目的抗原不能经自然感染途径免疫， 从而影响免疫效果。
祖。
DNA需达标;
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2. 良好的免疫原性
• 能促使机体产生：
– 高效价的保护性抗体 – 黏膜免疫 – 细胞介导免疫 – 并具有良好的免疫持久性
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3. 遗传稳定性
弱毒株的来源？
– 天然弱毒 – 采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒株
诱变为弱毒株
• 只有选择突变遗传性能稳定的菌毒株，才能最 大限度地防止其使用过程中毒力返祖的可能。
解决办法：使用基因工程技术对其进 行改造或取而代之
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3. 国内外使用的减毒活疫苗一览表
分类 病毒疫苗
细菌疫苗
名称
甲型肝炎减毒活疫苗
麻疹减毒活疫苗 腮腺炎减毒活疫苗 黄热减毒活疫苗
脊髓灰质炎减毒活疫苗
乙型脑炎活疫苗 风疹减毒活疫苗 水痘减毒活疫苗 登革热减毒活疫苗 流感减毒活疫苗 腺病毒减毒活疫苗 炭疽减毒活疫苗 布氏菌减毒活疫苗 卡介苗 伤寒减毒活疫苗 霍乱减毒活疫苗 鼠疫减毒活疫苗
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4. 生产适应性
• 易于培养 • 便于规模化生产 • 有利于生产工艺流程的可操作性和简化 • 有利于保证产品的产量和质量。
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二、减毒活疫苗制备技术要求
1. 基本要求
①设施与生产质量管理——中国《药品生产质量管理 规范》
②原、辅料:《中华人民共和国药典》、《中国生物 制品主要原辅材料质控标准》
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例：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株
减毒与免疫原 性达到平衡
SA14
原代地鼠肾细胞(PHK)
SA14-14-2/ PDK
连续传代：100代
原代狗肾细 胞(PDK)
传9代
第一代减毒变异株 12-1-7
PHK细胞
SA14-14-2/ PHK
蚀斑克隆
蚀斑克隆
性状不稳定 神经毒力返祖
病毒株SA14-5-3
1. 基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine) • 将与毒力有关的基因或基因片段删除，从
而获得缺失突变毒株 优点：
• 突变性状明确 • 稳定、不易发生毒力返祖
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
1. 基因缺失活疫苗(gene deleted live vaccine) • DNA病毒
残余毒力 指数过高
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五、减毒活疫苗研究面临的问题
2.安全性和免疫原性之间的协调——难题 霍乱减毒活疫苗： • 基因缺失株CVD112：
– 保护率：84% – 6名志愿者中：引起3人轻度腹泻
• CVD-103 HgR株：
– 对不同人群诱导 抗体应答悬殊 – 免疫原性不恒定
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五、减毒活疫苗研究面临的问题
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第一节 减毒活疫苗的原理与 现状
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一、减毒活疫苗的原理
全身性感染
临
（病毒性/细菌性感染）
床
现
临床感染
象
或亚临床感染(隐性感染)
持久性的免疫力
减毒活疫苗
– 模拟自然发生的感染后免疫过程。
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1. 定 义
减毒活疫苗 • 通过不同的方法手段 • 使病原体的毒力(致病性)减弱或丧失后 • 获得的一种 由完整的微生物组成 的疫苗制品。
①纯菌试验:
– 生长物做涂片镜检，不得有杂菌。
②噬菌体特异性试验:
– 特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应 无细菌生长。
③菌落、菌形检查: 应具有典型的菌落特征
– 涂片镜检：培养典型形态 – 特殊染色法：形态学鉴别
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检定内容
④活菌数测定:
– 一定温度、时间培后，单位体积的活菌数必须
在规定范围内。
减毒活疫苗
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第一个用于人体的减毒活疫苗
• 1902年，从患结核病的牛乳房里分离得到 一株牛型结核杆菌；
• Calmette和Guerin将此菌接种于5%甘油胆汁 马铃薯培养基，进行传代培养；
• 每隔2-3周传代一次，经过230余代，历时13 年，终于制备出减毒活疫苗——卡介苗 (bacille Calmette-Guerin， BCG)。
– 去除毒力基因的腺病毒，可用作减毒活疫苗株 ，也可作为载体疫苗的病毒载体。
• RNA病毒
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
2. 遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine) • 通过强、弱毒株共同感染细胞，二者之间
进行基因片段的交换，而获得的减毒活疫 苗。 特点：
很大的盲目性，致使筛选特定的遗传重组病毒比 较困难。
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2. 减毒活疫苗的特点
• 能引发机体感染、但不发生临床症状 • 其免疫原性足以能刺激机体的免疫系统、
产生针对该病原体的免疫反应 • 在以后暴露于该病原体时，能保护机体不
患病或减轻临床过程。
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二、减毒活疫苗的使用和研究现状
1. 使用现状
– 有的已完成历史任务而退役
• 牛痘苗
– 有的已经并正在继续发挥其良好的防病作用
histocompatibility complex， MHC)背景人群 的多位点的CTL应答; ④直接和间接地诱导传播途径的黏膜免疫应 答
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1.病原体的培养
如何减毒？
• 体外细胞培养
– 低温培养传代以产生冷适应株 – 在特定温度下选育温度敏感株
• 动物体内分段或连续传代
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致细胞病变效应
1.病原体的培养 (cytopathogenic effect，CPE )
减毒过度，免 疫原性不足
乳鼠体 内传代
PHK细胞
恢复一定的免 疫原性 13
2. 减毒的策略
传统方法： • 细胞传代 • 动物传代 • 蚀斑挑选 • 化学诱变 • 营养突变等
现代方法： • 应用基因工程技术，
删除致病基因
– 病原体减毒更彻底 – 遗传性能更稳定 – 安全性和免疫原性更平
衡。
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四、基因工程减毒活疫苗的构建策略
⑤浓度测定:
– 按《中国细菌浊度标准》测定浓度。