FISH技术及其在环境微生物中的应用

哈尔滨师范大学

学年论文

题目 FISH技术及其在环境微生物中的应用

学生李晓晶

指导教师王继华教授

年级 2009级

专业生物科学

系别生物学系

学院生命科学与技术学院

哈尔滨师范大学

2012年4月

论文提要

荧光原位杂交与微量自动照相集成技术(FISH)能够同时在单细胞水平原位进行细胞的分类鉴定和细胞对底物的吸收特性研究,这是微生物学研究领域的一大突破。目前,这一技术已有效应用于工程系统(污水处理厂、生物反应器等)和自然生态系统中微生物的研究。污染水体的原位强化净化及其生态修复与微生物也有着密切的关系,因此,这一技术的应用不仅能够提高工程系统污水处理效率, 也将为受损水生态系统的原位修复提供科学依据。

FISH技术及其在微生物学中的应用

李晓晶

摘要：微生物对整个生态系统具有重要的影响,了解和检测微生物的种类具有十分重要的意义。但是传统的培养方法又不能满足科学研究的需要,荧光原位杂交技术(FISH)就是今年发展起来的一种快速准确检测微生物的方法。较全面地介绍了FISH技术的优点、微生物的分离和固定方法，以及原位杂交过程，同时对FISH技术在环境微生物学中的应用作了详细研究。

关键词：荧光原位杂交检测环境微生物学种属特性功能特性

污水处理、受损水生态系统的原位修复均与微生物有着密切的关系。因此,对于相关微生物的研究是这一领域的重要研究内容之一。当前,在自然界的微生物群落中绝大部分种类尚不能进行培养(如海水中可培养的微生物只占到总数的0.001%～0.1%；淡水水体或底泥中相对较多,但也只占到总数的0.25%[1])。为了在尽量不破坏周围环境的基础上研究这些尚无法培养的微生物,在过去的十多年里,微生物学家引入了分子生物学技术,如荧光原位杂交(FISH)、多聚酶链(PCR)、DNA测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等[2]。这些技术在微生物生态学中的应用揭示了环境中微生物群落结构和多样性的大量信息。然而,这些方法一般不能检测微生物在其生存的微生态环中的功能特性。而在研究微生物时,不管是研究微生物的富集培养和分离,还是研究微生物技术的应用都需要在了解微生物分类鉴定的同时,了解微生物的各种功能特性。

有研究者已经开发了一些可以同时研究微生物分类鉴定和功能特性的方法,如FISH/CTC还原结合、MAR(微量自动照相术)和免疫荧光联用技术、FISH-微电极技术等,但这些技术在研究复杂环境微生物群落中的个体微生物时存在很多局限[3-4]。上世纪末,研究者开发研究了一种新技术,即荧光原位杂交(FISH)和微量自动射线照相(MAR)集成技术(本文中FISH/MAR技术),也有称其为MAR- FISH、STARFISH、Micro –FISH等[5-6]。应用FISH/MAR 能同时在原位水平从复杂微生物种群中获得特定微生物的种属和功能特性,从而更好地了解特定微生物在环境中的作用,更清楚地解释自然或人工生态系统中微生物多样性和微生物群落结构多样性的原因及其与微环境的相关关系。

1 FISH 技术简介

1.1原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:

如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

1.2实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

1.3特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

1.4应用

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

2 FISH技术在环境微生物研究中的应用

2.1工程系统中微生物功能特性及生理特性研究

这里所说的工程系统是指污水处理厂、生物反应器等人工构建的生态系统。FISH在这一领域的应用涉及到活性污泥中污泥膨胀微生物,活性污泥、生物膜和生物絮体中氨氧化菌、硝化菌、反硝化菌、硫细菌、铁(Ⅲ)还原菌等微生物生理和功能特性的研究。其中应用比较多的是污泥膨胀微生物。

2.1.1污泥膨胀微生物

污泥膨胀是污水处理厂运行管理的常见问题和难题。引起污泥膨胀的丝状菌具有丰富的多样性,不同类型丝状菌,来自不同污水厂的同一类型丝状菌都反映出不同的底物吸收特性。研究丝状菌的种群及功能特性,并将有关研究推广,可以帮助阐明导致活性污泥膨胀的环境因素,从而最终便于污泥膨胀类型的快速诊断以及针对病原微生物的生理特性实施合理的补救措施[7-8]。Nielsen等研究了不同环境条件下的活性污泥中的Thiothrix nivea 和Thiothrix属其它成员对14C标记的醋酸盐和14C标记的重碳酸盐的吸收特性[9]。研究明,Thiothrix细胞除具有异养和混合营养特性外,还具有化能无机自养生长特性。

2.1.2氮循环细菌

氮是引起水体富营养化的重要环境因子,细菌在氮的生物地球化学循环过程中起着极其重要的作用,于是氮循环细菌也就成为很多学者的研究对象。Daims等利FISH/MAR技术研究了Nitrospira类细菌(来自不同污水处理厂的硝化生物膜和活性污泥)在不同培养条件下对碳源的吸收情况[10]。Lee等用14C标记的重碳酸盐和NEU探针(β亚纲氨氧化菌的好盐和耐