活细胞工作站技术

智能（3）：全自动科勒照明
活 细 胞 工 作 站 的 构 成
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显微镜永远处于最佳状态!!
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智能(4)：全自动光强管理
5× 10× 20× 40× 63×
活 细 胞 工 作 站
物镜必须适合长时间工作在37℃左右、湿度在90%以上、 CO2浓度在5%左右的细胞生长环境中。
构 成
的
照明光强随放大倍数的不同而自动调节
智能(5) ： 一键式操作
活 细 胞
快速功能 控制键
作 站 的 构 成
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工
电控光路切换
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活 细 胞 工 作 站 的 构 成
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活 细 胞 工 作 站 的 构 成
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活 细 胞 工 作 站 的 构 成
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超快速荧光滤块转换
-
抑制水分蒸发
可达到的空气最大湿度60％
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Incubator system
暖风通过管道循环加热样品 通过CO2控制pH的稳定 通过加湿空气减少液体蒸发
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
没有冷凝水的困扰
气候箱不控制加湿和CO2浓度,因为: 在显微镜内可能会形成冷凝水 ! CO2会在显微镜表面形成碳酸腐蚀
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活细胞工作站的优点
实时观测 自动聚焦 单细胞追踪 多位点成像 成像速度快 图像清晰度高
活 细 胞 工 作 站 的 优 点
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活细胞time-lapse注意事项
一. 弱激发光改善荧光检测 二. 最大程度减少因各种原因造成的图像 模糊 三. 使细胞处于最佳的生理状态 四. 避免震动效应 五.准备标本的要点
细 胞 实 验 条 件 的 控 制 活
41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡， 个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全 部死亡。 而低温对细胞的影响要相对小，细胞处在4℃～ 36℃之 间，细胞的代谢速度会减慢，一般不会导致细胞死亡，再将 低温培养细胞转回36℃可以恢复细胞正常代谢活动。
快速荧光阻挡开关, (0.1S)以防样品淬灭 快速平稳的荧光滤块 转换(转换速度0,5S)
活 细 胞 工 作 站 的 构 成
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活细胞实验条件的控制
温度的保持； pH值的保持，即CO2的供应； 培养基离子浓度的保持；
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温度对细胞培养的意义
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度 （36.5℃±0.5℃）。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强。温度上升不 超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；
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智能（2）：全自动物镜转换器
在长时间实时摄影中，载物 台的频繁移动、载物台及其承 载的细胞培养设备等的自身重 量和各种器件的热胀冷缩必然 会导致聚焦平面的漂移，从而 影响图像的清晰度。 而物镜转换器的定时自动聚 焦则能够保证长时间实时摄影 过程中焦平面的稳定和图像的 清晰。
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活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
Heating Unit*
Tempcontrol 37-2 digital*
The Tempcontrol 37-2 digital* must always be switched off a few minutes after switching off the heating unit*. Otherwise the heating may not cool down properly.
制 控
的
Space for two manipulators Keeps the live cells in optimal conditions Large range of live cell accessory
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Heating Unit and Tempcontrol 37-2 digital
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从实验要求方面考虑
部件配置 活细胞实验条件 温度的保持； 加热部件：热台、空气加热 pH值的保持，即CO2的供 (气候箱)； 应； 培养基离子浓度的保持； CO2气体控制器、气候箱； 加湿装置和抑制挥发装置； O2的要求。 灌流装置＋全套支持部件
连续观察时间 短时间连续观察 长时间连续观察 最后注意整体连接问题
CO2-Cover MH for Heatable Universal Mounting Frame MH
通过 CO2-Controler控制CO2-cover内的气体流量
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21 CO2-Controller
离子浓度的保持
增加空气湿度
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制 Humidifier
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注 意 事 项
自动聚焦功能
活 细 胞 time-lapse 注 意 事 项
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(三):使细胞处于最佳的生理状态
高纯度CO2 CO2控制器：维持Ph
活
温度控制器
胞
细 time-lapse
加热器 气候箱 电动快门的使用（数十毫秒）：减少光损伤
注 意 事 项
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Transfection
Incubate the cells : 30-40% or 70-90 % confluent. Transfection : lipofectamine 2000 Transient transfection: used for imaging directly. Select stable cell lines: 48h, G418, 2-3weeks
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pH值的意义
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧 气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增 殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时
一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境 中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所 需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养 基的PH值。 大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细 胞培养将产生有害的影响。细胞耐酸性比耐碱性大 一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。每种细胞都 有其最适pH值。 细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方 法。 16 2010-5-25
活 细 胞 time-lapse 注 意 事 项
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单色仪的优点
活 细 胞
1）提供的激发光波长更精确，带宽更窄 2）不同波长的转换不需要更换任何光学元件， 更换速度很快，只需2-3ms
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time-lapse 注 意 事 项
荧光滤色块
GFP RFP CFP YFP CFP/YFP B/G/R
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实验温度控制
可加热的载物台和插件
细 胞 实 验 条 件 的 控 制 活
加热循环空气 物镜加热器 气候箱
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pH值的控制
通过控制air/CO2 混合空气来调节培养基pH值
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
CO2-Controller 2010-5-25 20
CO2-Controller和ML气候箱与CO2 Cover 联用
pH值的控制
不同的CO2-Cover，对应不同的插件
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
CO2-Cover HM CO2-Cover HP for Heating for Heating Insert M Insert P
CO2-Cover KH for Heatable Universal Mounting Frame KH-L
活
全自动科勒照明
胞 工 作 站 的 构 成
细
全自动光强管理 一键式操作
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智能（1）：全自动数控载物台
在进行活细胞实时摄影时需要对培养皿 中不同区域的细胞轮流进行定期的拍 摄，并且所有区域拍摄的照片最终要通 过计算机处理拼接成一张完整照片，或 将每一区域不同时间的照片做成电影。 这就要求视野的更换、回复原位等要达 到高速度、高精确度。手工移动载物台 已经不能满足这些要求，因此，载物台 的水平移动必须通过计算机的程序控制 来完成。
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(四): 避免震动效应
避免标本受到外部震动的影响，显微镜应该安装在防震台上。
活
防震台的使用
胞
细 time-lapse 注 意 事 项
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(五):准备标本的要点
尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（Nunc,LabTek,MatTek） 塑料培养皿在短波长激发时会发出自发荧光，降低了荧光检测 的信噪比。 0.17mm厚的玻璃底壁，高数值孔径物镜能发挥其最大效应。 对于不容易在玻璃上生长的细胞，使用覆盖了poly-lysine或相 活 似物质的玻璃底的培养皿。 细 尽量筛选比较亮的克隆。
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(二):最大程度减少因各种原因造成的
图像模糊
温度变化能引起显微镜镜体的轻微变形，导致物镜 和标本之间的距离变化产生离焦图像。 防止室温变化的效应:热变形主要来自室温变化、 空调以及开关门引起的气流等环境因素。
细 胞 time-lapse 活
防止内置电子元件引起的热变形：待温度稳定 后再开始工wenku.baidu.com（约20-30分钟）。 自动聚焦功能
培养基中的无机盐成分
培养基中的无机盐成分对调节细胞渗透 压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都 是必须的。 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培 养细胞对渗透压有一定耐受性。渗透压 在260－320mOsm/kg的范围都适宜。
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
液体的蒸发对渗透压的影响会随时间的 延续逐渐明显起来。
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EGFP
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ECFP
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绿色荧光蛋白 （Green Fluorescent Protein, GFP)
1) 可溶性蛋白，性质稳定。 2）荧光基团相当明亮 3）荧光在活细胞中即可观察，不需固定和 组织加工。 4）GFP基团和目的基因做成融合蛋白后， 可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。 5）表达GFP融合物的细胞能够在生活状态 进行实验和检测。
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Temperature sensor
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
The temperature sensor* must be connected to the heating unit*.
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八通道灌流给药系统
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显微操作器
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大容积气候箱不易密封，导致CO2消耗巨大
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系统连接示例
活 细 胞 实 验 条 件 的 控 制
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气候箱 Climate chamber
活 细 胞 实 验 条 件
High temperature stability necessary for live cell experiments Easy access to specimen and microscope
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(一):弱激发光改善荧光检测
造成活细胞time-lapse实验不能顺利进行的主要原因是过强 的激发光对细胞的损伤和对荧光的漂白，通过使用较弱的激发 光能够有效地增加采集荧光信息的时间。 1. 弱光激发 汞灯：全波段 氙灯：300-700nm 2. 扩大荧光检测效率 A. 降低环境光的影响 B. 使用高数值孔径物镜 (5×,10×, 20×, 40×, 63×) C. 选择匹配的滤色片：GFP，RFP，CFP，YFP D. 使用高灵敏度CCD, 细胞的光损伤较小 2010-5-25
活细胞工作站技术 (Live Cell Imaging System)
刘雅静 yjl@ustc.edu.cn 中国科技大学生命科学实验中心 生物楼340
主要内容
智能化显微镜的特点 活细胞实验条件的控制 活细胞工作站的优点 活细胞time-lapse注意事项 活细胞工作站与激光共聚焦的区别 活细胞工作站的应用方向 活细胞工作站的应用实例
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System overview
智能化全电动倒置显微镜 气候箱 Climate chamber 温度控制器 CO2控制器 软件系统
防震台 Antivibration table 遥控手轮 Smart Move
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智能化全电动倒置显微镜
全自动数控载物台 全自动物镜转换器