沉淀技术

第五章沉淀技术

学习目标：了解蛋白质的基本性质

掌握蛋白质沉淀的基本原理

掌握沉淀技术的基本方法

能够正确进行蛋白质的沉淀分离方法

第一节蛋白质沉淀的基本原理

沉淀是溶液中溶质由液相变为固相析出的过程。

沉淀技术是通过加入试剂或改变条件,使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术.

第一节蛋白质沉淀的基本原理

沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的.

一蛋白质的溶解性

蛋白质的溶解性是由其组成,构象以及分子周围的环境所决定.影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类.

蛋白质性质的因素有:分子大小,氨基酸序列,可离子化的残基数,极性/非极性残基比率,极性/非极性残基分布,氨基酸残基的化学性质,蛋白质结构,蛋白质电性,化学键性质.

溶液性质的因素有:溶剂可利用度,pH值,离子强度,温度.

二蛋白质胶体溶液的稳定性

蛋白质属于胶体分散系统.由于水化膜和双电层着两种稳定的因素,使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液.由于水化膜和双电层的存在,蛋

白质颗粒彼此不能接近,因而增加了蛋白质溶液的稳定性,阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来.

三沉淀动力学

溶解度是一个平衡特性，但是溶解度的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起:口热运动(布朗运动); 2对流运动，由机械搅拌产生:3差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中D和@两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，而机理3在沉隆过程中起主导作用(如在废水处理中)。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同

向聚集。

为了简化沉淀过程的动力学，可把沉淀过程分成下述6 个步骤: @初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合; @晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒; 3扩散限制生长，晶核在布朗扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快: @流动引起的生长，这些核通过对流传递(搅拌) 引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的; 5絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力; 6 聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体取得大小和阻力平衡。

第二节蛋白质沉淀技术实施

－、基本方法

蛋白质的沉淀有可逆和不可逆两种。生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是:盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、等点电沉淀法、有机聚合物沉淀法、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。

1.盐析法（中性盐沉淀）

盐析法中常用的中性盐有（NH4）2SO4、Na2SO4、NaH2PO4等。

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶”；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为“盐析”。盐析法突出的优点是:①成本低，不需要特别昂贵的热备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。

（1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水性基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子和溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。

（2）中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点。①溶解度大；②分离效果好；③不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。④价格便宜，废液可以肥田，不污染环境。

（3）盐析曲线的制作以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵

饱和度作图，即可得到盐析曲线。

（4）盐析的影响因素:①蛋白质的浓度；②pH值；③温度的影响。

2.有机溶剂沉淀法

（1）基本远离有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是最早使用的沉淀方法之一。其沉淀远离主要是降低溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，因而向有机溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间嗯相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。

有机溶剂的优点是:①分辨能力比盐析法高；②沉淀不用脱盐，过滤比较容易。

（2）有机溶剂沉淀的影响因素:①温度，多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。②样品浓度，通常，使用5～20mg／mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到很好的沉淀效果。③pH值，有机溶剂沉淀适宜的pH值。④离子强度。

3.选择性沉淀法

是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。

4.等电点沉淀法

用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法多与其他方法结合使用。

5.有机聚合物沉淀法

该法主要使用聚乙二醇作为沉淀剂。

6.聚电解质沉淀法

加入聚电解质的作用和絮凝剂类似，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用。缺点是往往使蛋白质结构改变。

7.金属离子沉淀法

一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效

8.亲和沉淀法

亲和沉淀是利用亲和反应远离将配基与可溶性载体偶联形成载体－配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择与蛋白质结合，当采用物理场（如pH、离子强度和温度等）改变时发生可逆性沉淀，从而利用目标分子与其配体的特异性结合作用及沉淀分离的原理进行目标分子的分离纯化，是蛋白质等生物大分子的亲型亲和分离技术之一。

二、沉淀工艺及其操作

沉淀方法有多种，沉淀工艺随沉淀方法的不同而不同，沉淀技术在实施过程中，应考虑3个因素:①沉淀方法和技术应具有一定的选择性，以使所要分离的目标成分得以‘很好的分离，选择性越好，目标成分嗯纯度就越高；②对于酶类和蛋白质的沉淀分离，除了要考虑沉淀方法的选择性外，还必须注意所用的沉淀方法对这类目标成分中的活性