乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展

［O% 2 OO］ 。这些探索为其他外源分泌蛋白在乳酸 的信号肽系列 ［ON］ 菌 中 的 大 量 表 达 奠 定 了 基 础。 MD<-IHDLV4I-A<A! 等 （O%%N） 通过插入 1 个氨基酸残基的合成肽使 $5 型人乳头状 瘤病毒 )9 蛋白和 /IF 融合蛋白的分泌效率显著提高。实验 证明， 来源于乳酸乳球菌的 P#3R& 信号肽 （ P#38J） 为目前已 知提高外源蛋白分泌效率最高的信号肽。 在细胞内表达的外源抗原不能充分地与黏膜免疫系统 接触而影响免疫应答强度是目前的一个主要问题。我们将 细胞内表达 ’()* 核衣壳蛋白的重组乳酸乳球菌经口服途 径免疫小鼠后， 可以在小鼠粪便中检测到抗 ’()* 的特异性 但是抗体滴度不高。这可能正是由于在细胞内表 @+7 抗体， 达的外源核衣壳蛋白不能充分的刺激黏膜免疫系统产生特 异性免疫应答。因此， 如何使表达在细胞胞浆中的外源抗原 ［OR］ 暴露于黏膜表面很关键。 6"=A 等 （O%%R） 在乳酸乳球菌中 该基因编码的金 成功表达来源于粪便肠球菌的 )!=. 基因， 属内切蛋白酶肠溶素 7 为一种乳酸乳球菌自溶酶， 可以调 控乳酸乳球菌的自溶。/@>) 系统表达该基因的乳酸乳球菌
’ABCD $ 7!="+D!# MAF=D<"AC A!="+D!# J<;=D"! ’’?> >J8 P<DM .9,.$O 83A7 *"<AC A!="+D!# M>* D3"=;3D /#3R )9 7$,7N ;U *J$ JA<A#"="FAC A!="+D!# (CI<3VE#3N
酸乳球菌可有效提高黏膜免疫系统提呈抗原及诱导特异性 免疫应答的能力， 具有成为新型口服疫苗诱导黏膜免疫应答 的潜力。 迄今为止， 已有多种病原微生物抗原在乳酸乳球菌中得
关键词：乳酸乳球菌； 外源蛋白； 抗原； 黏膜免疫； 疫苗 中图分类号：M3’ 文献标识码： ( 文章编号： $$$20"#$3（#$$"）$!0$"%$0$! 外降解是一个普遍存在的问题， 即使是在一些蛋白酶缺陷菌 株， 分泌蛋白的降解也经常发生， 而实验用乳酸乳球菌不产 生任何细胞外蛋白酶， 这有利于保持外源蛋白的完整性和功
史
达等： 乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展 W , 微生物学报 （O%%5） （R） R5
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源蛋白的表达量。研究表明， 该启动子的活性与培养基中的 并且其诱导效率可达 $%%% 倍以上 。 !"#"! 浓度成线形关系， 近年来由乳球菌表达的外源蛋白大多数都是在此系统的基 础上实现的。我们实验室在利用该系统表达猪传染性胃肠 炎病毒 （’()*） 核衣壳蛋白的研究中， 也证实了培养基中的 诱导物 !"#"! 浓度达到 $!+,-. 时， 即可以有效诱导 ’()* 核 衣壳蛋白在乳酸乳球菌 /01%%% 中表达。但是未发现培养基 外源蛋白的表达量与 中的诱导物浓度在 $ 2 &!+,-. 之间时， 诱导物浓度之间存在明显线形关系。 与此同时， 也相继开发出一些根据环境条件 （如 34 值， 温度或离子浓度等） 调节乳球菌启动子的外源蛋白表达系 统。
乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展
史 达，宋 岩，李一经"
（东北农业大学动物医学学院 哈尔滨 21$$’$）
摘
要： 乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌， 被公认为安全级 （ *.:.C6//8 C.?=*:7D.B 6+ +6E.， 微生物。近年来， FG(H） 是乳酸菌的代 对于乳酸菌作为宿主菌表达外源蛋白或抗原的研究取得了一定进展。乳酸乳球菌 （ !"#$%#%##&’ ("#$)’ ） 表菌种， 以其生长迅速、 易于操作等优点成为表达外源抗原， 作为黏膜免疫活载体疫苗的理想菌株。随着对乳酸乳 球菌基因工程的研究逐渐深入， 已发展了一系列组成型和诱导型乳酸乳球菌表达系统以及蛋白定位系统。破伤风 毒素片段 I、 布氏杆菌 JKLJ2# 蛋白等多种病原微生物抗原已成功在乳酸乳球菌中表达， 并已证明部分重组乳酸乳 球菌作为黏膜免疫疫苗可以同时刺激局部黏膜免疫应答和系统免疫应答。目前， 如何使活载体乳酸乳球菌以最佳 方式向黏膜免疫系统提呈抗原继而诱导有效免疫反应是该领域的研究热点， 也是巨大挑战。实现外源抗原在乳酸 乳球菌中的准确定位及与细胞因子的共表达是未来研究的重要方向之一。乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗 传递外源抗原具有广阔的应用前景。
随着分子生物学技术的不断进步和各种乳酸乳球菌外 源蛋白表达系统的成功开发， 利用乳酸乳球菌表达外源蛋白 已经相对容易， 但仅能够实现外源蛋白表达是远远不够的。 活载体细菌以什么方式向黏膜免疫系统提呈抗原， 如何使所 表达的外源抗原与免疫系统充分接触继而诱导有效免疫应 答是巨大的挑战， 也是目前该领域研究的热点。 #$" 准确定位外源蛋白在乳酸乳球菌中的表达位置 目前为止多数乳酸乳球菌表达的外源抗原都是以分泌 ， 因此提高重组乳酸乳球菌外源蛋白的分 形式表达的 （表 $） 泌效率对于促进黏膜免疫反应是必要的。 .D .;"< 等 （$11:） 将 1 个氨基酸残基的合成肽插入信号肽切割位点之后， 使外 源蛋白 /IF 在乳酸乳球菌中的分泌效率增加了 :%X 。随后 的几年中， .D .;"< 和 6AY! 等开发出多种适合于乳酸乳球菌
!
乳酸乳球菌是一种理想的外源蛋白表达宿主菌
乳酸乳球菌是乳酸菌中的典型菌种， 其全部基因组序列
［2］ 已经获得 。乳酸乳球菌作为表达外源蛋白的理想菌株有
其独特的优势
［#］
： 首先， 该菌长期以来一直被应用于食品发
酵和保存中， 实践证明是安全的。这就有别于其它未被归于 安全范围内的活疫苗载体 （如沙门氏菌， 大肠杆菌和痘病毒 等） ； 而且与上述载体不同的是， 乳酸乳球菌抗原性弱， 载体 本身不会引起强烈的免疫应答， 可以利用同一载体对动物进 行多次免疫； 其次， 乳酸乳球菌本身分泌蛋白较少， （一 P+Q!1 种分子量为 !1RS6 的未知蛋白） 是迄今唯一可检测的由乳酸 乳球菌分泌的蛋白。这一特点减少了载体微生物的自身蛋 白对外源分泌蛋白的干扰。外源性分泌蛋白容易发生细胞
一特点可以避免因其长期定植而导致的免疫耐受。 近年来， 对于乳酸乳球菌外源蛋白表达系统的研究逐渐
［!］ 深入。T)7Q.C+ 等 先后用组成型和诱导型启动子实现了外
源蛋白在乳酸乳球菌的高效表达。针对蛋白过量表达对细 胞造成的毒害作用， 开发出多种含有不同诱导型启动子的表 达系统， 通过诱导物、 抑制物或环境因素的控制将外源基因 的表达限定在需要的范围内。 （233!） 构建的以乳糖操纵子为基础的乳糖诱导 B. U=+ 等 转录系统为一种代表性控制型表达系统， 但该系统诱导水平 较低使其应用受到限制。另外， 使用大肠杆菌噬菌体 -K 启 ［2$］ 动子的表达系统也具有同样的弊病。 V’ （233"） H)//7W6: 等 开发了基于乳球菌噬菌体的表达系统， 此系统将噬菌体诱导 使外源蛋白表达效率增加 ’$ SX( 扩增和基因表达结合起来， 倍以上， 但最终会导致不可控制的细胞溶解， 因此仍不能成 为理想的外源蛋白表达系统。 针对以上问题， （233"） 开发了一种基于乳酸 B. G)8,.C 等 乳球菌 :7+( 启动子的可调控表达系统 （ XYI40+8+,.5， ,<. :7+7: 。 :7+( 启 动 子 的 活 性 由 :7+G 和 ?=:,C=//.B .ZQC.++7=: +8+,.5） （膜结合感应蛋白） 接 :7+T 组成的双组分调节系统调节： :7+T 受外源 :7+7: 肽信号， 自身磷酸化后激活 :7+G （胞浆内反应调 启动下游基因的表达。该 节子） ， 之后 :7+G 激活 :7+( 启动子， 表达系统与其它表达系统比较具有明显的优势： 首先诱导物 在一些国家是作为天然安全的保鲜 :7+7: 为一种生物安全肽， 剂应用于食品工业中； 更重要的是可以根据需要严格控制外
" 通讯作者。 -./： %"0!12011232!2$； 40567/： 8797:*/7; 86<==> ?=5
作者简介： 史
达 （23%2 @ ） ， 女， 黑龙江人， 硕士研究生， 主要研究方向为兽医微生物学。 40567/： A=+<7+<7B6; <=,567/ > ?=5
ห้องสมุดไป่ตู้
收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$10$30#$； #$$"0$’0$3； #$$"0$’0$’
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微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
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［&］
［5］ 性使它们在应用于儿童和免疫缺陷者时受到限制 。针对
基因工程致弱微生物大范围应用的安全和环境问题， 发展了 以乳酸 菌 为 代 表 的 非 致 病 性 革 兰 氏 阳 性 菌 载 体。除 了 其 一些乳酸菌具有益生作用和免疫修饰作用， 可以 (678 地位， ［9］ 作为佐剂激活宿主的免疫系统 。已证实植物乳杆菌可在 大鼠诱导特异性免疫反应， 并且未发现对大鼠有毒性作用或
［$% 2 $1］ 到有效表达 （表 $） 。 乳酸乳球菌表达的微生物抗原
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［’］ 能正常发挥； 最后， 乳酸乳球菌基本不在胃肠道内定植 ， 这
乳酸菌 （ /6?,7+ 6?7B N6?,.C76， 是一群能大量发酵碳水 J(O） 化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌， 包括乳酸球菌、 乳酸 杆菌、 双歧杆菌等十几个属。乳酸菌是人和大多数动物肠道 内的常见细菌， 在食品工业各个领域中的长期应用已证明其 无致病性， 被公认为安全级 （ *.:.C6//8 C.?=*:7D.B 6+ +6E.， FG(H） 微生物。#$ 世纪 %$ 年代， 为更好的控制其参与食品加工的 过程， 人们开始致力于对乳酸菌生物学性质和分子机制的研 究。分子生物学技术的不断进步为探索其新的应用潜力提 供了基础： 如利用基因工程乳酸菌在生物反应器内发酵食品 或直接在人和动物消化道内生产蛋白等， 其中最有前景的应 用即是乳酸菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜 表面， 继 而 同 时 诱 导 黏 膜 免 疫 和 系 统 免 疫。乳 酸 乳 球 菌 （ !"#$%#%##&’ ("#$)’ ） 是乳酸菌的一个重要菌种， 以其生长迅速、 易于操作等优点成为表达外源蛋白、 作为活载体疫苗传递抗 原的理想选择。
O%%R JCA#-;H"I- UACF"3A<I，> （ FQ=;3CA#-"F） ，7 （ A!FS;<DH） .;FAC"LA=";!# ;U SD=D<;C;+;I# A!="+D!# "! .AF=;F;FFI# CAF="#；（ 8 #DF<D=DH） W
# 重组乳酸乳球菌作为活载体疫苗诱导黏膜免疫 的研究现状及热点
［:］ 损伤作用 ， 这些特性使乳酸菌作为黏膜免疫活载体疫苗具
有很强的优势。 与某些乳杆菌不同的是， 乳酸乳球菌不属于人和动物的 正常微生物群， 不会定植于口腔或胃肠道， 在一定程度上避 免了因为长期刺激形成的免疫耐受。因此， 乳酸乳球菌是作 为黏膜免疫活载体疫苗的理想候选菌种。 /;<=;! 等 （$11&） 发 （ ’’?>） 的重组乳酸乳球菌给小 现用表达破伤风毒素片段 > 鼠口服免疫后， 免疫小鼠 @+7 水平显著提高。其它实验亦表 免疫 明， 用细胞内表达 ’’?> 的重组乳酸乳球菌口服免疫后， 小鼠血清中 @+( 和粪便中 @+7 水平都显著提高， 而且比未免
［1］ 疫小鼠的抗 ’’?> 皮肤感染能力强 。这些实验均证实了乳
! 表达外源抗原的乳酸乳球菌是理想的黏膜免疫 活载体疫苗
黏膜免疫作为机体的第一道屏障阻止经口腔、 呼吸道、 生殖道等途径感染的病原微生物入侵， 是预防感染的最佳途 径。 理想的黏膜免疫活载体疫苗可以促进抗原和免疫系统 之间的有效接触、 刺激体液和细胞免疫反应、 在单剂量免疫 以后产生长期的免疫保护作用， 并且稳定、 无毒性。目前研 究得最多的是致弱病原菌载体， 因其仍可能保持侵袭性和毒 表"