枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究

枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究
摘要产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌在前期培养基质优化的基础上, 采用了分阶段溶氧控制策略，在5L发酵罐中进行过程控制,即在0～13 h控制溶氧为40%，13～21 h控制溶氧为50%，13 h后控制溶氧为40%。

探索分阶段溶氧对枯草芽孢杆菌发酵过程的影响。

利用单因素法对一株枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基成分进行优化，确定发酵培养基各成分最适宜配比。

最后确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/ 100 mL)：酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.3 ,CaCl2 0.3 ,F e2+0.5;最适摇瓶发酵条件为: 菌龄12h,接种量3.5 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达507.53 U/ mL, 比在其他无机盐条件下的产量都高。

此外,还进行了5 L 罐放大实验,装液量为3 L,在5 L 罐所确定的最适工艺条件下,发酵单位可达520.2 u/ mL 。

关键词：碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；液体培养基
引言碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,主要应用.于生产加酶洗涤[1] ,另外,在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化学试剂等领域也有应用。

我国在20 世纪70 年代初期就成功开发了碱性蛋白酶,并实现了工业化生产[2]。

目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL 以上,与国外先进水平相差甚远[3]。

本实验所采用的产碱性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌,其实验发酵单位为22 000 u/ mL,与国外大型酶制剂公司所报道的生产水平30 000 u/ mL 相差较大[4]。

本实验对该菌株的发酵培养基利用单因素实验确定其基本成分，选择出适合该菌株发酵的最适培养基，从而使其酶活有一定的增长,为其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法
1.1 菌种与培养基
1.1.1 菌种
枯草芽孢杆菌(Baci11us subti1is)由农业与生物技术学院发酵工程实验室提供。

1.1.2培养基
1.1.
2.1 种子培养基
胰蛋白胨5g, 酵母浸粉5g, 葡萄糖10g, K2HPO410g
1.1.
2.2 发酵培养基
酵母浸粉5g, 麦芽糊精20g, 柠檬酸钠3g, CaCl23g, F e2+0.5g
1.2 试剂及仪器
酪氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、棉籽饼粉、酵母浸粉、麦芽糊精、柠檬酸钠、CaCl2、K2HPO4、KCl；pH计、722 分光光度计、恒温水浴锅、离心机。

1.3 方法
1.3.1以无机盐为单因素优化发酵培养基
取牛肉膏0.5g、葡萄糖0.5g、用水定溶至150mL，pH 值自然。

将以上中的培养液分别装入6个三角瓶中（各25mL），将FeSO4 0.02% ,Fe2(SO4)3 0.02%, MgSO4、溶液分别加入到其中5个三角瓶中并标记。

灭菌，121℃高压灭菌20min。

接种
在已灭菌的六个三角瓶中接入菌种，放入振荡培养箱在37℃下培养48h，转速200r/min。

在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐成分。

1.3.2碱性蛋白酶活力的测定
取培养液于1200r/min离心15min 取上清液稀释至10和50倍，采用福林法测定蛋白酶活力[5]。

取试管7支（一支为空白对照，样品重复两次）各加入稀释的样品1mL，40℃水浴预热3min，再加入同样预热过的1%干酪素1mL，精确反应10min，加0.4mol/ L三氯乙酸2 mL终止反应，混匀水浴沉淀15 min后过滤，吸取滤液1 mL加入0.4mol/ L的 Na2CO35 mL 混匀，再加入1 mL 福林试剂摇匀置40℃水浴20min，空白测定同上，但在加干酪素之前先加
0.4mol/ L的三氯乙酸2 mL，波长下以空白为对照，用分光光度计680nm波长下测定样品的A680
酶活力单位定义为：在温度55℃ pH10.0 条件下，1min 水解酪素产生1μg 酪氨酸所需酶量定义为1 个酶活力单位，以U 表示。

样品的酶活力X(U/ml)＝A680×K×n×4/10
式中：A—样品平行实验的平均吸光度
K—吸光常数
4—反应试剂的总体积(ml)
10 —反应时间(min )
n—稀释倍数
1.3.2 根据以上发酵培养基的优化，选择有利于产酶的无机盐为主要影响因素配置发酵培养基进行发酵罐控制发酵，在发酵前要进行电机的标定，发酵罐的实消。

1.3.3 发酵到10小时后每隔2小时利用福林发测酶活。

2 结果与分析
2.1 碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线
碱性蛋白酶测定的标准曲线结果如图1 所示。

由该曲线求得线性回归方程为：
Y=89.317X-2.048，R2=0.9935,K=104.6459本法在酪氨酸浓度0～60μg/ml 范围内有良好的线性关系。

2.2 无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响
由图2可知无机盐离子Fe2+对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白的影响比较显著，原因是Fe2+离子是生物氧化必需的。

Fe2+离子影响了枯草芽孢杆菌菌体的生长，从而影响了枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶。

查阅文献知道Mg2+也是菌体生长的必需的无机盐离子，由图2可以看出Mg2+对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响不是很明显，这是因为Mg2+和Fe3+ 一样在配制的过程中形成了沉淀。

Fe2+有利于芽孢杆菌产碱性蛋白酶。

2.3 5L发酵罐过程控制
在摇瓶实验基础上,进行了5 L 罐中的放大实验。

接种量: 3.5 % , 温度:32 ℃,转速:300 r/ min。

对发酵过程中的菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600进行了测定,所绘发酵曲线如图3 所示。

5 L罐发酵单位最高可达507.53 U / mL 。

●--DO▲—酶活■—OD600图3发酵过程曲线
由图3可知发酵到14小时后取发酵原液测出其OD600、酶活和PH都很高。

15-21h，酶活和OD600都迅速减小，PH也在下降，这段时间中可能是由于加入了消泡剂而引起了染菌或是溶氧降低造成的结果。

22-27h，酶活一直在持续增加，PH相对减小的比较缓慢，OD600在稳定一段时间后突然增加。

28-35h，酶活开始持续降低，PH和OD600也在跟着减小。

3 讨论
采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用单因素试验确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为（g/L）酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.3 ,CaCl2
0.3 ,F e2+0.5;最适摇瓶发酵条件为: 菌龄12h,接种量3.5 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达507.53 U/ mL。

本实验采用5 L 发酵罐、装液量为3L,研究了芽孢杆菌产碱性蛋白酶的扩大培养条件。

在摇瓶水平的基础上，结合本实验室5 L 小型发酵罐具体情况和相关文献，以菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600，考察它们对碱性蛋白酶产率的影响。

结果表明，较优发酵条件是，菌体PH 6.09、粗酶液中酶活力520.2U/mL和发酵液中OD600 0.371。

查阅文献资料目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL 以上，所以本次实验的酶活是偏低的，原因主要有第一：培养条件的优化不是很合理，导致发酵罐里的菌种没有良好的生长，有的菌体因为营养不良提前死亡。

第二：加入消泡剂的用量太多，导致溶氧降低，枯草芽孢杆菌生长的不好，不产生大量的碱性蛋白酶。

参考文献：
[1] 华章熙,徐清1 洗涤剂酶应用手册[M]1 北京:中国轻工业出版社学报,1999139
[2] 薛林贵1 我国碱性蛋白酶的应用及研究进展[J ]1 微生物学通报,1997 ,24
(6) :370～371
[3] 杜连祥1 工业微生物学实验技术[M]1 天津:天津科学技术出版社学报,1992 ,274
[4] 肖怀秋, 林亲录, 李玉珍, 等. 中性蛋白酶芽孢杆菌 BX-4 产酶条件及部分酶学性质[J]. 食品与生物技术学报, 2005, 24(4): 42-46.
[5] 王福荣, 郭风茹, 田栖静, 等. QB/T 1803 — 1993 工业酶制剂通用试验方法[S]. 天津: 轻工业部食品工业学报, 1993.。