树突状细胞的分离纯化与鉴定

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猪骨髓树突状细胞的体外扩增及鉴定

ｅｅｌｏ，ｑｅｌｏｒｏｇｆＣａｄｅｐｅｅｉｌｅｏ７ｍｌｕｓｎ￣ｅｏｎｓｍａｒｏｍｎｌＬ．ｏｄ・ｅｓｈ￣ｄｔ￣ａｍｒｌｙｎｘｒｓｄｈ曲ｅｌｆｏｅｌｄ，ｔｔｔｕｔｓｆｕａｃｌｉＭＲＣｎｕｓｅ３ｉ￣ｏｏＤｓｖＢｃｅａｖｒｐｅｉｌｏｈｅＴｅｓｎ
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树突状细胞实验报告

一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。

2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。

3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。

二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。

DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。

本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。

三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。

2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。

四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。

（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。

（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。

2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。

（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。

（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。

3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。

（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。

五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。

2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。

3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。

（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。

树突状细胞体外分离扩增技术研究进展

树突状细胞体外分离扩增技术研究进展彭卫斌１综述；沙卫红２＋审校摘要：树突状细胞（ＤＣ）是目前所知的体内功能最强的专职抗原呈递细胞，是机体免疫反应的始动者，被称为机体防御病原微生物侵袭的重要“哨兵”，在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用。

获得大量高纯度且表型、功能典型的ＤＣ是上述基础和临床研究的前提。

从直接分离提取到添加细胞因子诱导扩增ＤＣ研究获得很大进展，成为当今免疫学及肿瘤治疗学等相关学科的研究热点。

本文对ＤＣ体外分离、纯化及扩增方法作一简要综述。

关键词：树突状细胞；分离；扩增；细胞培养中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－２３６９１２００９）１１－０６７９－０４ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＰＥＮＧＷｅｉ－ｂｉｎ。

ＳＨＡＷｅｉ—ｈｏｎｇ”．１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ，ｓｔｔｏｓｐｉｔａｌ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎ磐ｚｈｏｕ５１０１８０．Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；‘Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈ－ｓｈａ＠１６３．ｅｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ＤＣ）ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉ—ｖｉｒａｌｉｎ－ｆｅｅｔｉｏｎｓａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｋｎｏｗｎａｓｔｈｅｍｏｓｔｐｏｗｅｒｆｕｌａｎｄｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｉｎｖｉ—ＶＯ．ＨｏｗｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙＤＣｗｉｔｈｈｉ。

树突状细胞培养与鉴定

树突状细胞的培养与鉴定【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。

方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。

在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。

结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。

流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。

淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。

结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。

【关键词】树突状细胞；磁珠；流式molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sortingperipheral blood mononuclear cells (pbmc) with dynal magnetic negative isolation kit. monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (il-4) and granulocyte-macrophagecolony-stimulating factors (gm-csf) for 7days. cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。

人子宫蜕膜树突状细胞DEC-205 +HLA-DR +CD11c +的分离纯化与鉴定

ｎｅｎｅｔｔｅｓａｄｔｌａｃｅｆｕ．ＭｅｈｄＴｅｆｓａｙｇｓｔｎｒ～２ｗｅｔｔｎｄｃｕｌｓｅｗｓｄｓｅｓｄｏｒｏｈｔｔｏｓｈｅｈｅｒｅｔｉ７１ｋｇｓｉ）ｅｉａｔｓａｉｒｒｌａｏａｏｄｕｉｐｅ
ＤＥＣ一０Ａ — ２５ＨＩＤＲＣＤＵｃｉＡｄｌｅｕｎｕｔＵｔｒｓ
Ｚｅ－ｎＵＮａ —ｕ，ＥＧＧｏｑｏｇＬｏｇｍｉＨＵＷｎｅｇｆ，ＹＡＪｎｈｉＺＮｕ —ｉＩＨｎ－ｅｉ２ｎ，（．ｅａｔｅｔｆｇｎｃｌｙＳｅｚｅｏｇａｇＷｍｎａｄＣｉｒｎｅｌａｅＨｓｉｌ１Ｄｐｒｎｏｙｅｏｇ，ｈｎｈｎＬｎｇｎｏｅｎｈｄｅ＇ＨａｈＣｒｏｔ，ｍｏｌｓｔｐａ
（．１深圳市龙岗区妇幼保健院妇科，广东深圳５８７；２深圳市疾病控制中心，广东深圳５８２）１１２ห้องสมุดไป่ตู้．１００
［摘要］目的：探讨人子宫蜕膜树突状细胞的分离方法和诱导培养的最佳条件，为研究树突状细胞在母胎免疫耐受中
ｔｅｇｎｒｔｄｃｌｒｄｎｉｅｙｐｅｏｙｉｎｕｃｉｎｌｍｅｈｄ．ＲｅｓｌＡｏｌｏ．— ３ｌｈｅｅａｅｅｌｗｅｅｉｅｔｆｄｂｈｎｔｐｃａｄｆｎｔａｔｏｓｓｉｏｕｔｓｔｔｆ１０．× ０ａ

树突状细胞及其前体细胞分选

03
树突状细胞及其前体细胞分选的方法
基于表面标志的分选方法
总结词
基于表面标志的分选方法是最常用的树突状细胞及其前体细胞分选方法，通过抗体与细胞表面抗原的特异性结合，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
详细描述
这种方法利用树突状细胞及其前体细胞表面特有的抗原标记，如CD11c、CD123等，通过与相应抗体结合后进行磁性分离或流式细胞仪分选。该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够有效地分离出纯度较高的目标细胞。
02
通过分选树突状细胞及其前体细胞，可以进一步研究它们的生物学特性和功能，为免疫学研究提供更多有价值的信息。
03
树突状细胞及其前体细胞分选还有助于开发新的免疫疗法和疫苗，为人类健康和疾病治疗提供更多选择。
树突状细胞及其前体细胞分选的应用
在疫苗研发中，通过分选特定类型的树突状细胞，可以设计出更有效的疫苗，提高免疫应答的效果和持久性。
基于细胞活力的分选方法
总结词
基于细胞活力的分选方法是根据细胞活力的差异，将活力较高的树突状细胞及其前体细胞分离出来的方法。
详细描述
该方法利用不同细胞活力的特点，通过特定的染色或标记技术，将活力较高的树突状细胞及其前体细胞选择性地分离出来。该方法能够保证细胞的活性，有利于后续的实验和应用。
基于细胞大小和密度的分选方法
免疫荧光染色
利用特异性抗体对分选后的细胞进行免疫荧光染色，通过显过检测特定基因的表达水平，评估分选后细胞的纯度和功能状态。
分选结果的应用前景
疾病治疗
利用分选得到的树突状细胞及其前体细胞进行疾病治疗，如肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病治疗。
药物筛选
将分选得到的细胞用于药物筛选，以发现具有潜在治疗作用的药物分子。

bmdc细胞提取步骤

bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。

b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。

c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。

d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。

e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。

2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。

b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。

c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。

3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。

b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。

c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。

d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。

4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。

b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。

c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。

d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。

5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。

b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。

c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。

d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。

BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。

小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定

ＢＬ／小鼠肺组织经ＩＡＢｃ型胶原酶消化、密度梯度离心、Ｄｌ免疫磁珠分选纯化Ｄｓ流式细胞术鉴定分选ＤｓＣ１ｃＣ，Ｃ纯度，倒置相差显微镜观察孵育细胞生长状态，扫描电镜和透射电镜观察ＤｓＣ超微形态，流式细胞术检测肺间质ＤｓＣ１ｃＣ１ｂＣ８Ｃ的Ｄｌ、Ｄｌ、Ｄ６和Ｉ表型。结果：一分选获得的肺问质ＤｓＣ经鉴定，纯度为９．９ ±５６％，ＲＭＩ４培养基中生长状态良好，２５％．２在Ｐ１０６少数细胞形成小细胞集落。ＤｓＣ超微形态观察显示细胞表面多见长１ａ集的树枝状突起，胞器不发达，～２ｂ密ｍ细细胞核形不规则。９％以上肺间质ＤｓｏＣ为未成熟状态或前体Ｄｓ低表达成熟标志物ＩｂＣ８，Ｃ，．和Ｄ６并具有异质性，４％起源于髓系细胞分化。Ａ近０
中国免疫学杂志２１年第１０ —８Ｘ．０１０．１ｏ：０３６／．ｓ．００４４２１．９０２ｓ
・
免疫学技术与方法・
小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定①
王宏伟陆江阳田光② 刘茜赵敏杨毅康佳蕊
（解放军总医院第一附属（０）３４医院病理科，京１０４）北００８
中国图书分类号Ｒ６．３４７文献标识码Ａ文章编号１０．８Ｘ（０１０．８４０００４４２１）９０１．５
［摘
要］目的：建立肺间质树突状细胞（Ｃ）Ｄｓ的分离与纯化方法，为肺间质ＤｓＣ的相关研究提供实验基础。方法：性雄

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

ｃｌｒｄＤｓｘｒｓｅＸ２（ｅｒｅｔＣ）ｎｏｔａｕｅＤｓｘｒｓｅａｏｉ００ｐｔｉｔｕｔｅＣｐｅｓｄ０６ｔｋｒｆａＤｓ，ａｄｍｓｍｔｒＣｐｅｓｄｍｊｒｓｃｍａｉｌｙｕｅｈｍａｏｒｅｈｔｂｉ
髓细胞诱导ＤＣ及其培养、纯化的方法，为下一步的研究提供基础．
Ｈｏｐｔｕｍｉｇｕｍｎｕｎ５０，ＣｉａｓｉｌＫｎｎ，ＫｎｉｇＹｎａ６０１ａｏｆｎ１ｈｎ）
［ｂａｔＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｏｓｆｓｌｉ，ｃｌｒｇａｄｉｅｔｉｔｇｏａｂｎＡｓｃ］ｒｊｃｉｏｅｐｏｅｍｅｄｏｉａｎｖｈｒｏｔｇｕｔｉｎｄｎｉｃｉｆｒｔｏｅｕｎｆａｎ
ＺＨＡＮＧＳｅｇ— ｎｎ ”，Ｌｉ，ＲＡＮＪａｇ—ｈａ”，ＳｈｎｉｇＩＬｉｎｕＨＡＯＪｎｃｕ，Ｌｈｉ－ｈｎａＩｕ”，ＬＵＪｎ ’ ＺＩｉｇ‘
（）Ｄｐ．ｆＮ．ｐｔｂｌｒａｃｅｔｕｇｒ；２）Ｄｐ．ｆＴｓｎａｏａｏ，Ｔｅ１ｔｅｐｅｓ１ｅｔｏｏＨｅａｉａｙＰｎｒａｃＳｒｅｙｏｉｉｅｔｏｅｔｇＬｂｒｒｉｔｙｈｓＰｏｌ’
［键词］大鼠；树突状细胞；骨髓关
［中图分类号］Ｒ９．［３２１文献标识码］Ａ［文章编号］１０ — ７６（０８２— ０１４０３４０２０）００４ —０
Ｉｏｌｉｓａｔｏｎ，ＣｕｌｕｒｎｄｄｅｉｃｔｏｎｔＢｏｎｅｔｅａＩｎｔｆａｉｉｏｆＲａＭａｒｗ．ｒｖｅｄｅｒｏ．．ｄｅｉＤｎｄｒｔｃＣｅｌｉｉｌｓ

树突状细胞的鉴定

一、流式细胞仪分离法【原理】根据待分离的免疫细胞膜表面抗原的不同，制备出相应的荧光标记抗体，分离前，首先将待分离细胞制成单细胞悬液，经相应的荧光标记抗体染色后，进入流式细胞仪。

此细胞仪以激光为光源，通过高速流动系统将样品中的细胞排列成行，一个一个地从流动室喷嘴处流出，形成细胞液柱。

液柱与高速聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发后产生散射光并发射荧光，由光电倍增管接收光信号并转化成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨出细胞的类型，并对各类型分别计数和统计。

同时，细胞根据其表面的电荷使液滴瞬间感应相应的带电性，然后在电场的偏转作用下进入不同的收集管，从而将各种免疫细胞分离。

用FACS(流式细胞仪)分离细胞准确快速，分选纯度高（为99%），不损伤细胞活性，可在无菌条件下进行，并可直接统计出各类细胞的相对含量。

【器材与试剂】1.抗CD11c、CD83的单克隆抗体。

2.FITC—羊抗鼠IgG。

3.正常小鼠IgG 。

4.细胞洗涤液(NaCl 8.47g，K2HPO4 4.11g，KH2PO4 1.36g，NaN3 0.1g，20ml，加蒸馏水至1000m1)。

5.红细胞裂解液(KHCO3 1.0g，NH4C1 8.3g，EDTA 37mg，加蒸馏水至100ml)。

6.固定液(25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2.0g，加无血清上述细胞洗涤液至100m1)。

7.肝素抗凝血。

8.离心机、流式细胞仪等。

【方法】1.取肝素抗凝血0．4ml，分别加入4支小试管中（其中3支为待测管，1支为对照管）各0.1ml。

然后在各待测管中分别加入0.1ml抗CD11c、CD83的单克隆抗体(1：1000稀释)，对照组加入.正常小鼠IgG ，30℃孵育45min。

2.加入细胞洗涤液3ml，1000r／min，离心2min。

以洗去未结合的抗体，重复洗2次。

3.摇匀管底沉淀细胞。

加入0.1ml FITC-羊抗鼠IgG，30℃孵育45min。

4.加入红细胞裂解液3ml，见红细胞悬液变为真溶液时，立即以1000r／min离心2min。

小鼠脾脏树突细胞的分离培养及鉴定_程晓明

文章编号:1000-5404(2003)23-2141-02　技术方法小鼠脾脏树突细胞的分离培养及鉴定Isolation culture and identification of spleen-derived DC from mice程晓明,王长征,李淑平,钱桂生 (第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆400037) 提　要:目的　分离小鼠脾脏树突细胞(Dentritic cell,DC)。

方法　运用脾脏DC先贴壁后悬浮的特性进行分离、培养。

从形态学、功能及表型进行鉴定。

结果　电镜显示了DC特有的形态;混合淋巴细胞反应表明少量的DC即可明显促进T淋巴细胞增殖(P<0.01);流式细胞仪分析显示其表面分子CD11c及MHCⅡ呈高表达。

结论　从脾脏中可分离培养高纯度的功能性DC,可用于研究其生物学特性。

树突细胞(Dentritic cell,DC)是体内最重要的抗原呈递细胞(APC)[1],它的表面表达丰富的与抗原呈递有关的MHCⅠ类和Ⅱ类分子以及多种共刺激分子,可在其分布的部位捕获、加工抗原,迁移至淋巴器官中活化T、B淋巴细胞,从而在免疫应答中发挥启动作用,因此,分离高纯度的功能性DC是研究其生物学特性机制的前提。

1　材料与方法1.1　实验动物 4～6周健康BALB/c小鼠20只(第三军医大学实验动物中心提供),雌雄不限,体质量16～20g。

1.2　完全培养基(pH7.2～7.4) 每1000ml完全培养基含胎牛血清(FCS,Hyclone公司)100 ml,丙酮酸钠(0.1mol/L,Hyclone公司)10ml,2-巯基乙醇(2-ME) (0.1mol/L,Sigm公司)0.5ml,RPMI1640(Hyclone公司)890ml。

临用前新鲜配制。

1.3　小鼠脾脏树突细胞的分离培养脱颈法处死小鼠,无菌打开腹腔,取出脾脏放入冷PBS中,将其捻碎并滤过100目无菌钢网,收集脾细胞悬液;1300r/min 洗涤5min×3次;用完全培养基20ml重悬细胞于250ml培养瓶(Falcon公司)中,37℃,5%C O2培养箱内孵育2h;用完全培养基20ml剧烈洗摇培养瓶,并吸弃悬液,共4次;加入完全培养基20ml,37℃,5%CO2培养箱内孵育过夜;收集悬浮细胞。

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离_培养及鉴定

ｄａｙｓｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ ×４００）
图２培养第９天的ＤＣ扫描电镜形态学观察（ ×３０００）Ｆｉｇ．２ＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＤＣｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ９
ｄａｙｓｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ × ３０００）
第９天收集ＤＣ分别加入ＦＩＴＣ标记抗大鼠ＭＨＣⅡ 、抗大鼠ＯＸ６２，ＰＥ标记抗大鼠ＣＤ８０、ＣＤ８６，同时设ＰＥ或ＦＩＴＣ标记的ＩｇＧ抗体做阴性对照．流式细胞仪进行表型检测、分析．１．５ＤＣ功能检测方法１．５．１ＤＣ分泌ＩＬ－１２含量培养的第５、９天
ＤＣ离心后收集细胞上清．采用双抗夹心ＥＬＩＳＡ法测定ＩＬ－１２含量，按试剂盒说明书操作，根据标准曲线用间接法求出各孔ＩＬ－１２的含量．１．５．２同种混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）处死Ｗｉｓｔａｒ大鼠，无菌条件下取出脾脏加ＲＰＭＩ１６４０培养液研磨并通过不锈钢筛网，加入红细胞裂解液静置５ｍｉｎ，以ＰＢＳ洗涤细胞２次，再以ＲＰＭＩ１６４０重悬，于３７ ℃ 孵育２ｈ，收集未贴壁的细胞，用ＲＰＭＩ１６４０完全培养液重悬，加至尼龙毛柱上于３７ ℃孵育３０ｍｉｎ，以１６４０培养液冲洗出的细胞即为同种异体Ｔ细胞，将其以１６４０培养液悬浮后，调整细胞至１×１０６／ｍＬ作为反应细胞，分别将培养５、９ｄＤＣ以１６４０完全培养液悬浮后，加入终浓度为２５ｍｇ／Ｌ的丝裂霉素，于３７ ℃ 孵育３０ｍｉｎ后，以１６４０培养液洗涤３次，洗涤后分别以每孔１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４个细胞加入９６孔板，作为刺激细胞，每组各３复孔，每孔再加入１×１０５／１００ μＬ同种异体淋巴细胞，作为反应细胞，终体积为２００ μＬ，置３７ ℃、５％ＣＯ２孵箱培养４ｄ，离心弃去１００ μＬ上清，每孔加入５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ５０ μＬ，孵育４ｈ后离心去全部上清，每孔加入二甲亚砜（ＤＭＳＯ）１００ μＬ，酶联免疫检测仪测定４９０ｎｍＯＤ值，结果取３孔均值．１．６统计学处理

人脾脏树突状细胞的分离纯化与鉴定

人脾脏树突状细胞的分离纯化与鉴定吴功雄;杨志华;涂腊根【期刊名称】《解剖学研究》【年(卷),期】2003(25)2【摘要】目的建立人脾脏体外培养树突状细胞的新方法。

方法人脾脏细胞悬液培养 2h后获得贴壁的单核细胞 ,加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF) 10 0 μg/L或rhGMCSF 10 0 μg/L +重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 ) 5 0 0k/L ,体外培养 1周 ,收集悬浮细胞 ,以流式细胞仪分析细胞表型及抗原内吞能力 ,alloMLR检测细胞抗原呈递功能。

结果以细胞因子培养 7d生成的悬浮细胞 ,2 0 %～ 80 %表达树突状细胞特异性标志CD1a ,表达高水平的MHC Ⅱ、B71、B72分子 ,具有较强的抗原内吞能力 ,抗原内吞能力及T淋巴细胞活性与人外周血单核细胞培养获得的DC相似。

结论从人脾脏获得的贴壁的单核细胞 ,体外以rhGMCSF +rhIL 4培养。

【总页数】3页(P120-122)【关键词】脾脏;树突状细胞;分离纯化;鉴定【作者】吴功雄;杨志华;涂腊根【作者单位】广州市卫生学校解剖学教研室【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定 [J], 王宏伟;陆江阳;田光;刘茜;赵敏;杨毅;康佳蕊2.人脾脏树突状细胞的培养及鉴定 [J], 曹云新;曲萍;杨安钢3.大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定 [J], 贺伟峰;吴军;罗高兴;易绍萱;黄赤兵;陈希炜;郑峻松;马兵;雷晓4.人子宫蜕膜树突状细胞DEC-205^+HLA-DR^+CD11c^+的分离纯化与鉴定[J], 祝文峰;袁建辉;曾国琼;李红梅5.大鼠肝脏树突状细胞的分离纯化及鉴定 [J], 燕飞;汪志军;李运华;朱坚胜;朱敏;汤永志因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

树突状细胞检测方法

树突状细胞检测方法
嘿，咱今儿就来聊聊树突状细胞检测方法这档子事儿。

你说这树突
状细胞啊，就像是身体里的小哨兵，可重要着呢！那怎么才能知道它
们是不是在好好工作呀？这就得靠检测方法啦。

先来说说流式细胞术吧。

这就好比是给树突状细胞来个大点名，通
过各种标记，能清楚地知道它们的数量啊、状态啥的。

你想想，这是
不是很神奇？就像在茫茫人海中一下子就能认出特定的那些人一样。

还有免疫组化呢，这就像是给树突状细胞拍个特写照片。

能让我们
在显微镜下清楚地看到它们的样子，是不是很厉害？这能帮助我们更
直观地了解它们的分布和特征呀。

再讲讲酶联免疫吸附试验，这就好像是个超级侦探，能检测出和树
突状细胞相关的各种分子，从而推断出它们的活动情况。

你说妙不妙？
咱平时做这些检测，不就是为了更好地了解身体里的这些小哨兵嘛！要是它们出了啥问题，咱不就麻烦啦？那我们不得赶紧想办法解决呀！要是没有这些检测方法，咱不就像盲人摸象，啥都不知道啦？
比如说，要是不知道树突状细胞的数量少了，那免疫系统可能就没
办法好好工作啦，各种病菌不就趁机捣乱啦？那我们不得生病呀！所
以说，这些检测方法可太重要啦，它们就像是我们了解身体内部情况
的眼睛呀！
那检测的时候可得仔细着点，就跟咱出门得好好打扮一样，不能马虎呀！要是检测错了，那可就糟糕啦。

你说这树突状细胞检测方法是不是很有意思？它们能帮我们揭开身体里的好多秘密呢！咱可得好好利用这些方法，让自己的身体健健康康的呀！这可不是开玩笑的，咱得重视起来呀！总之，树突状细胞检测方法是我们了解身体、保护身体的重要手段，我们可不能小瞧它们哟！。

免疫学实验技术总结

免疫学实验技术总结免疫学是一门研究生物体免疫系统结构和功能的学科，而免疫学实验技术则是研究和理解免疫系统的重要工具。

这些实验技术涵盖了从细胞水平到分子水平的研究，帮助我们揭示免疫反应的机制、诊断免疫相关疾病以及开发新的免疫治疗策略。

以下是对一些常见免疫学实验技术的总结。

一、免疫细胞的分离与鉴定免疫细胞包括淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们在免疫反应中发挥着不同的作用。

分离和鉴定这些细胞对于研究免疫功能至关重要。

1、外周血单个核细胞（PBMC）分离通过密度梯度离心法，利用FicollPaque等介质，可以将外周血中的PBMC与红细胞、粒细胞等分离。

PBMC主要包含淋巴细胞和单核细胞。

2、淋巴细胞的纯化可以使用磁珠分选法，将带有特定表面标志物的淋巴细胞从PBMC 中分离出来。

例如，通过抗CD4或抗CD8抗体包被的磁珠，可以分别纯化出CD4+T细胞和CD8+T细胞。

3、免疫细胞的鉴定常用流式细胞术进行免疫细胞的鉴定。

通过荧光标记的抗体与细胞表面标志物结合，然后在流式细胞仪中检测荧光信号，从而确定细胞的类型和比例。

此外，免疫细胞化学染色也是一种常用的方法，通过抗体与细胞内或表面的抗原结合，然后用显色剂显色，在显微镜下观察。

二、免疫细胞功能检测了解免疫细胞的功能对于评估免疫状态和免疫反应具有重要意义。

1、 T 细胞增殖实验常用的方法有3H胸腺嘧啶掺入法和MTT法。

在刺激物（如抗原、丝裂原）的作用下，T 细胞会发生增殖。

通过检测细胞掺入放射性胸腺嘧啶或MTT的代谢产物，可以反映T 细胞的增殖能力。

2、细胞毒性 T 细胞（CTL）杀伤活性检测经典的方法是51Cr 释放法。

靶细胞被51Cr 标记后与CTL 共同孵育，CTL 杀伤靶细胞后，51Cr 释放到上清中，通过检测上清中的放射性强度来反映CTL 的杀伤活性。

现在也有一些非放射性的检测方法，如CFSE标记法。

3、细胞因子的检测细胞因子在免疫调节中起着关键作用。

树突状细胞的培养及成熟的鉴定_李望

树突状细胞的培养及成熟的鉴定李望，张升宁，冉江华，苏晓三，李来邦，陈奕明（昆明市第一人民医院肝胆胰一科，云南昆明６５０１０１）［摘要］目的探讨人体外周血树突状细胞在体外培养诱导其成熟的方法，通过得到成熟的细胞培养技术，对树突状细胞功能的研究奠定实验基础．方法通过Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法得到单个核细胞，再诱导使其分化、扩增、纯化形成稳定的树突状细胞，通过树突状细胞自身形态、特异性表型，抗原摄取能力，鉴别培养的细胞，从而得到具有典型特征的树突状细胞．结果树突状细胞培养第７天，加入ＬＰＳ后，倒置显微镜及扫描电镜下观察，树突状细胞成熟中，细胞胞质增大，细胞膜表面能形成大量树突状突起，表面标志物ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ的表达增高（Ｐ＜０．０５），共聚焦显微镜下，成熟的树突状细胞对抗原的吞噬能力减弱．结论Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法能够得到稳定的树突状细胞体外培养体系．［关键词］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法；树突状细胞；表型；抗原；吞噬［中图分类号］Ｒ３９２．１２［文献标识码］Ａ［文章编号］２０９５－６１０Ｘ（２０１５）０３－００３４－０４ＴｈｅＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＩｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭａｔｕｒｅＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓＬＩＷａｎｇ，ＺＨＡＮＧＳｈｅｎｇ－ｎｉｎｇ，ＲＡＮＪｉａｎｇ－ｈｕａ，ＳＵＸｉａｏ－ｓａｎ，ＬＩＬａｉ－ｂａｎｇ，ＣＨＥＮＹｉ－ｍｉｎｇ（Dept.of Hepato-biliary-pancreatic Surgery ，The 1st People ’s Hospital of Kunming ，Kunming Yunnan６５０１０１，China ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｉｎｖｉｔｒｏ，ｉｎｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｐｒｅｐａｒｉｎｇｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＣＤ１４＋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｔａｂｌｅｍａｔｕｒｅＤＣｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｂｙｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｔｙｐｉｃａｌＤＣｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｗａｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ，ａｎｄｐｌｅｎｔｙｏｆｒａｄｉａｌｄｅｎｄｒｉｔｅｓｆｒｏｍｃｅｌｌｂｏｄｉｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｉｎｖｅｒｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＤ８３，ＣＤ８０，ＣＤ８６ａｎｄＨＬＲ－ＤＲｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｓｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｎｇｏｆＤＣｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｉｍＤＣｓｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ，ｗｈｉｌｅｉｔｗａｓｗｅａｋｅｎｅｄｉｎｍＤＣｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｉｍＤＣｓｃｏｕｌｄｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏＤＣｓｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ；Ｄｅｎｒｄｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ；Ａｎｔｉｇｅｎ；ＰｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓJournal of Kunming Medical UniversityCN 53-1221/R昆明医科大学学报2015，36（3）：34～37［基金项目］云南省科技厅－昆明医科大学联合专项基金资助项目（２０１１ＦＺ２９９）［作者简介］李望（１９８６～），男，湖南株洲市人，医学硕士，住院医师，主要从事肝胆外科临床及研究工作．［通讯作者］张升宁．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｓｎ８１３＠１６３．ｃｏｍ树突状细胞是机体内发现的具有最强专职抗原提呈细胞，因其在成熟过程中能伸出大量树突样突起而得名，人体树突状细胞起源于造血干细胞，外周血树突状细胞在数量上不足外周血单个核细胞的１％，它能摄取、加工处理抗原，并能将处理后的抗原递呈给Ｔ淋巴细胞．未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，成熟的树突状细胞能有效激活初始型Ｔ淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答［１］．１材料和方法１．１材料外周血细胞由健康、成人自愿捐献，淋巴细胞分离液（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＲＰＭＩ－１６４０培养液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＲｈＧＭ－ＣＳＦ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人白介素４（ｒｈＩＬ－４）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），脂多糖（ＬＰＳ）（ｓｉｇｍａＵ．Ｓ．Ａ），胎牛血清（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＦＩＴＣ－ＣＤ８６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－５．５ＨＬＡ－ＤＲ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＯＬＹＭＰＵＳ倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ），微型扫描电镜（日立，ＴＭ１０００），流式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ），激光共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＳＰ５０）．１．２实验方法１．２．１树突状细胞培养抽取空腹、健康成人外周血细胞，肝素抗凝，将细胞生理盐水稀释，加入淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核层细胞层，３７℃５％ＣＯ２培养箱中孵育２．５ｈ，获取贴壁的单个核细胞层，经含ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ），ｒｈＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）的用ＲＰＭＩ－１６４０完全培养基孵育１ｄ后，即得到未成熟的树突状细胞，诱导树突状细胞第６天用脂多糖（ＬＰＳ）刺激产生成熟的树突状细胞．１．２．２树突状细胞形态学观察分别于树突状细胞培养第１天，第６天，第７天，倒置显微镜下观察树突状细胞形态的改变．收集培养７ｄ的树突状细胞，经多聚赖氨酸沉淀于盖玻片上，用３％的戊二醛和１％饿酸固定，经乙醇梯度脱水，扫描电镜下观察树突状细胞形态．１．２．３细胞表型检测在２．０×１０５／ｍＬ的树突状细胞悬液中，分别加入ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ单抗，２ｈ后，经ＰＢＳ离心洗涤，加入抗原，４５ｍｉｎ后流式细胞检测．１．２．４分别于树突状细胞培养第６天及第７天，加入ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，３７℃５％ＣＯ２培养箱中继续孵育１ｄ，准备ＰＥ－ＣＤ１１ｃ荧光素标记的单克隆抗体于２００μＬ的ＰＢＳ，至期望浓度．单抗放置于冰上．低温保存，共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力．１．３统计学处理实验数据以均值±标准差（x±s）表示，数据处理应用ＳＰＳＳ软件包进行．流式细胞组间差异比较采用配对ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义．２结果２．１倒置显微镜下观察树突状细胞的形态从倒置显微镜下可以看出，树突状细胞在培养第２天细胞呈均匀分布，形态单一，散在排列．晃动培养板可见随板晃动的细胞．在散在排列的细胞中，可分辨出呈团簇状排列的细胞团块．细胞培养第６天，加入ＬＰＳ后，可见细胞较大，胞质丰富，悬浮的细胞，细胞膜表面分布许多分枝状突起，见图１．ＡＢＣＤ图１树突状细胞经分离、诱导、培养后不同时期树突状细胞的生长变化Ｆｉｇ．１ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｅｒｉｏｄｏｆＤＣｓａｆｔｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＡ：０ｄ（２００×）；Ｂ：２ｄ（４００ｘ）；Ｃ：６ｄ（４００×）；Ｄ：７ｄ（４００×）．３５第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定表１树突状细胞成熟前后细胞表型阳性细胞数改变［％，（x ±ｓ）］Ｔａｂ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ［％，（x ±ｓ）］树突状细胞ＣＤ１１ｃＣＤ８０ＣＤ８６ＨＬＡ－ＤＲ加入ＬＰＳ前３７．０±１．５１７．０±１．１１７．２±０．９５４．２±０．４加入ＬＰＳ后３９．０±２．５２４．９±０．７＊５９．３±２．５＊６５．９±１．６＊图２培养第７天树突状细胞（５０００×）Ｆｉｇ．２ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ（５０００×）加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图３树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．３ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ与加入ＬＰＳ前比较，＊Ｐ＜０．０５．２．２扫描电镜观察树突状细胞形态电镜下观察树突状细胞，细胞表面粗糙，有层叠状褶皱，细胞膜上分布大量外生的突起，见图２．２．３树突细胞表型变化加入ＬＰＳ前后，树突状细胞表型有明显改变．ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ在加入ＬＰＳ前后，其细胞阳性表达率明显增加，差别都具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明加入ＬＰＳ后，树突状细胞共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ类分子的表达增加．而ＣＤ１１ｃ加入ＬＰＳ前后，差别无统计学意义（Ｐ＞０．０５），提示ＬＰＳ对ＣＤ１１ｃ无明显影响，见图３、图４及表１．２．４共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光，见图５．共聚焦显微镜下可看到经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记的细胞膜，使细胞膜表面呈现红色荧光，并可辨别树突状细胞表面形态，树突状细胞表面不规则，有大量外生的树突状突起，细胞内可见ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，呈现绿色荧光的抗原，在细胞内部均匀分布．加入ＬＰＳ后，随树突状细胞的成熟，树突表面突起明显增加，但细胞对抗原的摄取明显减弱．第３６卷36昆明医科大学学报图４树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图５示树突状细胞成熟前后抗原吞噬能力的比较（×８００）Ｆｉｇ．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ（×８００）图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光．３７第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定３讨论３．１从形态学上分析树突状细胞１９７３年Ｓｔｅｉｎｍａｎ首次发现树突状细胞，研究中发现树突状细胞在免疫应答机免疫耐受中占有重要地位，树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ＤＣ）广泛分布于脑以外的全身组织及器官，仅占人外周血单个核细胞的１％，因其具有许多分枝状突起故名，在倒置显微镜下［２］，树突状细胞培养第１天，在ＩＬ－４及ＧＭ－ＣＳＦ诱导下，细胞由散在、均匀排列的单加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后独细胞，逐渐形成大量贴壁的细胞集落团块，细胞大小从整体上观察均匀一致，未见明显突起．而树突状细胞培养至第７天，加入ＬＰＳ后，从培养液中可明显辨别出大量细胞质丰富，在细胞培养液中呈悬浮状态的树突状细胞，细胞膜表面呈现许多分枝状突起，细胞集落团块减少或消失．电镜下，观察树突状细胞，细胞较大，细胞表面粗糙，有大量外生型突起．本实验采用Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法，从外周血中分离出ＣＤ１４＋单个核细胞，根据树突状细胞短暂性贴壁的特性，分离出树突状细胞，极大简化实验分离过程，并且能够避免在间接贴壁中收集转移贴壁细胞对前体细胞的丢失，此实验方法在大多实验中得到证实［３，４］．在ＣＤ１４＋细胞诱导成熟过程中，加入ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４，能使ＣＤ１４＋单个核细胞向未成熟的树突状细胞转化，ＧＭ－ＣＳＦ是树突状细胞发育重要的细胞因子，能诱导单个核细胞形成细胞集落，并生产少量树突状细胞，ＩＬ－４的加入，能抑制中性粒细胞及巨噬细胞的产生，促进单核细胞向未成熟树突细胞转化［５］，在试验中，倒置显微镜下观察的大量集落刺激单位形成相一致．脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，加入磷酸脂多糖（ＬＰＳ）后，未成熟细胞摄取ＬＰＳ，并与Ｔｏｌｌ样受体４结合，增强ＩＦＮ的表达，从而导致未成熟树突细胞向成熟树突状细胞转化［６］．３．２从表型上分析树突状细胞未成熟树突状细胞表面表达低水平的共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ类分子，而高表达一系列受体，如Ｔｏｌｌ样受体、Ｃ型凝集素等，其形态与功能相适应，高表达的受体有利于未成熟细胞识别、摄取抗原相关的物质．一旦未成熟树突状细胞受到炎性刺激，未成熟细胞则会向成熟细胞转化，其中共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ表达水平显著提高，其意义在提供Ｔ细胞活化的信号．如Ｔ细胞受体与ＭＨＣ－抗原复合体结合传递信号，Ｔ细胞表型ＣＤ２８与ＣＤ８０／ＣＤ８６结合传递信号，从而启动获得性免疫应答［７］．实验中，树突状细胞ＬＰＳ刺激后，ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ的表型显著较刺激前表达增高，提示未成熟树突状细胞向成熟细胞转化，这种现象与理论相适应．实验中发现，ＣＤ１１ｃ在ＬＰＳ刺激前后，都出现高表达现象，提示ＣＤ１１ｃ可能是树突状细胞共有表型，有待进一步研究证实．从抗原摄取能力分析树突状细胞未成熟树突细胞具有较强的抗原吞噬能力，抗原通过与树突状细胞Ｔｏｌｌ样受体结合，并通过内（下转第４４页）发症和医疗意外；与其他行业相比，医务人员面对的是身有疾病的患者，其工作关系到病人的生命的安全，行业的特殊性要求他们必须要有更强的责任心，其职业行为必须更加严格规范．医院的各项医疗规章制度是对医务人员的基本要求，若不严格执行将给患者带来极大的安全隐患，也使医院和医务人员在面对纠纷时处于十分被动的境地．医疗纠纷虽然不可避免，但是通过医院管理者对其成因的分析，可以在一定的程度上防范医疗纠纷的发生．医院管理部门要不断修订和完善各类制度规范，还要加大宣传、教育和督导力度，提高医务人员的医疗水平和执行力，确保各项制度规范严格落实．只有这样才能有效的控制医疗纠纷的发生，才能为患者就医提供更加舒适、更加轻松的医疗环境．［参考文献］［１］唐春爱．２２４７７例出院病人疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国医院统计，２００８，１５（４）：３４６－３４７．［２］李雅立．出院患者２２４５９例次疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国冶金工业医学杂志，２０１１，２８（６）：６３０－６３１．［３］张涛．医疗纠纷的成因探讨［Ｊ］．国际护理学杂志，２００７，２３（５）：５３４－５３６．［４］宋会臻．难以避免的医疗意外与对策探讨［Ｊ］．中国误诊学杂志，２００７，７（９）：２０２８－２０２９．（２０１５－０１－０３收稿）吞、胞饮等作用，将抗原摄取进入细胞内，进而完成对抗原的加工处理过程．同时进一步诱导树突状细胞成熟，成熟的树突状细胞对抗原的摄取、加工能力较弱，但能发挥抗原递呈作用，将处理的抗原，递呈给Ｔ淋巴细胞，同时通过一系列共刺激分子、细胞因子等作用，诱导Ｔ淋巴细胞活化．模式抗原卵白蛋白（ＯＶＡ）有良好的免疫原性，是常用的半抗原载体，用用荧光标记的ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，能较好的反应树突细胞摄取、加工抗原吞噬能力，在共聚焦显微镜下观察细胞内ＯＶＡ分布、密度状况，可作为树突状细胞成熟能力鉴别方法之一．目前对于人体树突状细胞研究已有大量报道，引起自身的特性，对树突状细胞的研究具有重要的临床意义．Ｇｉｌｉｅｔ等早期发现，在人体血液及组织中有两种特怔性的树突状细胞组群：髓样树突状细胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｙｅｌｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｍＤＣ）以及类浆细胞样树突状细胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｐＤＣ），外周血中ｐＤＣ的比例较ｍＤＣ明显较高时，可诱导出现机体出现免疫耐受［８］．在未来的发展趋势中，树突状细胞将在肿瘤、移植免疫等方面研究中发挥重要的作用．［参考文献］［１］ＷＡＬＬＥＴＭＡ，ＳＥＮＰ，ＴＩＳＣＨＲ．Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｄｅｎ－ｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＭｅｄＲｅｓ，２００５，３（３）：１６６－１７５．［２］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵＪ，ＳＴＥＩＮＭＡＮＲＭ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２（１９）：２４５－２５５．［３］高伟生，罗荣成，马树东，等．人外周血树突状细胞的分离与鉴定［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（１１）：２１０５－２１０９．［４］陶晓根，莫宝定，陈剑，张蕾，等．健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定［Ｊ］．临床和实验－医学杂志，２０１２，１１（２３）：１８３７－１８３９．［５］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，１８（４）：７６７－８１１．［６］ＫＡＷＡＩＴ，ＡＫＩＲＡＳ．ＴＬＲｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆ－ｆｅｒ，２００６，１３（６）：８１６－８２５．［７］ＲＥＩＳＥＳＯＵＳＡ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎａｍａｔｕｒｅａｇｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２００６，６（６）：４７６－４８３．［８］ＧＩＬＩＥＴＭ，ＬＩＵＹＪ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＣＤ８ＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｐｒｉｍｅＩＬ－１０ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＪＥｘｐＭｅｄ，２００７，２０４（１５）：１０５－１６１．（２０１５－０１－１３收稿）第３６卷44昆明医科大学学报4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444（上接第３７页码）。

树突状细胞在抗白色念珠菌感染中的作用

（上海玉博生物科技有限公司），重组小鼠细胞因子
ＧＭ— ＣＳＦ（ｒＧＭ— ＣＳＦ）和重组小鼠细胞因子ＩＬ一４（ｒｌＬ一４，美国Ｒ＆Ｄ公司），小鼠ＩＬ一１２ＥＬＩＳＡ试剂盒
生素在临床上的广泛应用，以及器官移植、介入治
关键词：树突状细胞；白色念珠菌；Ｔ细胞免疫；ＩＬ一１２；抗原呈递细胞；动物，实验；小鼠中图分类号：Ｒ～３３文献标志码：Ａ文章编号：１００９ — ８１９４（２０１３）０８ — ０００９ — ０３
分泌，随着时间的推移，有缓慢增多的趋势。培养到４ｈ时，２组ＩＬ一１２浓度比较差异无统计学意义（ｔ＝０．４２，尸＞Ｏ．０５）。培养ｌ２、２４ｈ时，ＤＣｓ＋ＣＤ组分泌的ＩＬ一１２浓度分别为（１５０．１２￣５６．３８）和（１２３６．２４￣１２５．３３）ｎｇ・Ｌ～，显著高于ＤＣｓ组的（９３．６５￣２９．１８）和（３４７．５６￣７６．５４）ｎｇ・Ｌ（拄３．９７８、ｔ＝３２．８３７，均Ｐ＜０．０５）。结论于成熟，分泌ＩＬ一１２增多，并可能参与调节免疫应答。ＤＣｓ受ＣＤ刺激后能趋
夹用临床医学２０１３年第１４卷第８期

小鼠dc细胞提取原理

小鼠dc细胞提取原理小鼠DC细胞提取是一种常用的实验技术，用于研究小鼠的树突状细胞（Dendritic Cell，简称为DC细胞）。

DC细胞是免疫系统中重要的抗原呈现细胞，具有调节和激活免疫反应的功能。

以下是小鼠DC细胞提取的原理和步骤。

1. 小鼠准备：选择适合的小鼠品系，根据需要的DC细胞类型进行选择。

小鼠可以通过麻醉和牺牲来收集组织。

2. 组织切割：使用无菌器械将收集的小鼠组织切割成小块，并将其转移到称重器皿中，以便进一步分类和处理。

3. 组织消化：将组织块置于含有适当酶解酶的消化液中（如胰蛋白酶），并在37摄氏度的恒温搅拌条件下进行消化。

消化时间根据组织类型和实验需求而定。

4. 细胞分离：经过适当的消化时间后，将消化液过筛或过滤，并使用无菌操作将细胞转移到离心管中。

离心操作可分离细胞悬浮液和残留的组织碎片。

5. 密度梯度离心：为了分离出DC细胞，可以将细胞悬浮液进行密度梯度离心，以分离不同细胞类型。

常用的密度梯度离心介质有离心液（如Ficoll）。

6. DC细胞纯化：通过离心梯度离心后，可以通过其他细胞纯化方法（如磁分选或流式细胞术）进一步纯化DC细胞，以获得更纯的细胞群体。

7. DC细胞检测：通过染色或使用特定的抗体标记方法，可以对提取的DC细胞进行检测和鉴定。

这可以包括对DC细胞特异标志物的检测，如CD11c、CD11b、CD80和CD86等。

小鼠DC细胞提取原理涉及多个步骤，从选择小鼠到最后的细胞检测，每一步都至关重要。

正确操作和技术的运用将有助于获得高质量、纯净的小鼠DC细胞用于后续的实验研究。

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树突状细胞的分离纯化与鉴定自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。

现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。

DC的纯化方法包括两大类: (1) 物理方法:①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞> DC = 抗体产生细胞> B细胞> T细胞; ②根据细胞的大小比重进行分离, 包括聚蔗糖2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性/ 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。

以下就不同组织DC的分离作一综述。

1 从外周血直接分离DC首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。

常用方法有:(1) Ficoll不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心, 速度(170 g～1 000 g)和时间(20～45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。

玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC 分为ER+ 和ER 2细胞,其中ER+ 主要是T细胞。

Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B 细胞、NK细胞和粒细胞, 所得的“新鲜DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到85 %～90 %。

如果将ER2细胞培养36 h再加2次各40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏附细胞置于1415 %甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞, 可得到90 %～95 %纯度的“培养DC” (c2DC) 。

f2DC和c2DC分别具有未成熟 DC和成熟DC的典型特征。

Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞,培养36 h去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心, 高密度部分富含B细胞, 低密度部分DC纯度为40 %～80 %Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME) 处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经14-15 %的甲泛匍胺RPMI 1640溶液(含10 % FCS) 离心, 低密度部分富含DC; 再用免疫磁珠分选出CD14、CD19、CD16、CD3和CD33 + CD14dim细胞, 证实为DC前体细胞, > 90 %表达 CD33 + CD13 +。

最近有报道用免疫磁珠连接单抗M2DC8从PBMC中一步分离出一类DC (占血白细胞015 %～1 %) , 其纯度为97 % , 这可能是至今为止最简捷的分离方法。

该细胞具有DC的典型特征: 递呈抗原给静息T细胞、诱导MHC I限制性CTL应答, 表达CD86、CD40。

与单核细胞相比, 它低水平地表达HLA2DR、CD33、CD45RO , 高水平地表达 CD45RA、CD11c , 它特别高水平地表达FcγR III (CD16) , 使它与单核细胞区别开来。

这类细胞与已经确立的一般骨髓源性DC的区别在于表达M2DC8 , 缺少CD83和胞浆内p55抗原, 因此它可能代表中间阶段(intermediate developmental stage) 的DC细胞。

2 从DC前体诱导扩增DCz从CD34 + 干细胞前体诱导扩增DCCaux用抗CD34 mAb和GAM IgG免疫磁珠、minimacs分离柱从人脐血中获得高纯度的CD34 + HPCs (80 %～99 %) ,将其置于RPMI 1640全培养基中(加有SCF、GM2CSF和TNF2α及人AB+ 血清) 培养; 5～6 d后洗去人血清, 用FITC2OKT6 (CD1a) 和PF2leu2M3 (CD14) 单抗标记培养细胞, 经流式细胞仪分选出CD14 + CD1a和CD14、CD1a + 亚类, 以(1～2)×105/ ml的浓度接种到含GM2CSF和TNF2α的培养基中再培养6～7 d , 可获得相当数量的DC , 证实CD34 + 细胞可分化《上海免疫学杂志》2001年第21卷第2期 ©1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 为两种细胞:LC型DC和CD14源DC (具有强大的抗原摄取和独特的诱导静息B细胞分化为IgM分泌细胞的功能)。

Ahuja用Ceprate干细胞收集系统获得CD34 + PBHP (含10 % FBS) 他用改良lscov‘s DMEM培养基而不用人AB+ 血清, 用干细胞因子SCF (20 ng/ ml) 、GM2CSF(50 ng/ ml) 、IL2、4和TNF2α (10 ng/ ml) 作为刺激因子, 最终可获得> 99 %的CD33 + 细胞, 表达多种DC相关表面分子, 混杂的T细胞 (CD34 + ) 、B细胞(CD19 + ) < 1 %～3 %。

Fujii的方法与Ahuja的方法相似, 他用抗CD34 mAb5612包被的M2450磁珠从外周血中一步分离出CD34 + HPCs , 经DETACHaBEADsCD34释放出来后接种到含GM2CSF (100 ng/ ml) 、和TNF2α(215 ng/ ml) 的培养基中培养, 2 ×105CD34 + HPCs可获得(115 ±012) ×106CD1a + DC。

前体细胞扩增DC因为CD34 + 干细胞在外周血中含量非常稀少( <011 %) , 所以Romani和Bender同时报道了另一种方法,即利用外周血或脐血中含量相对较高的CD34前体细胞诱导扩增出大量的DC。

这种方法包括启动阶段和分化(成熟) 阶段。

将CD34前体细胞在RPMI 1640培养基中(加有GM2CSF和IL24) 培养6～7 d , 之后加入单核细胞条件培养基进行分化(Romani认为仅GM2CSF和IL24作用的DC是不完全成熟的, 加入单核细胞条件培养基可使细胞完全成熟而且保持较长时间的稳定, 本方法的独特之处就在于得到的DC充分成熟而且稳定) 。

利用这种方法可从40 ml外周血得到 (018～313) ×106和(1～3) ×106的细胞,所得细胞具有成熟 DC的所有典型特征。

若供血者经GM2CSF预处理则细胞得率可提高6倍。

若将RPMI 1640培养基换成V2XIVO、AIM2 V , 则所得的DC还可用于临床作为辅助治疗。

所以该法可为临床研究提供大量DC 。

从CD14 + 前体细胞扩增DCChassin和Randolph用连续性流式离心或用免疫磁珠阴性选择获得PBMC中低密度单核细胞CD14 + 前体(不论CD34 + 或CD34)细胞, 置于RPMI 1640全培养基中(加有50 ng/ ml GM2CSF和1 000 u/ ml或200 u/ ml IL24) , 培养10～15 d也可获得较大量的DC , 这些细胞表现出DC的典型特征。

从骨髓干细胞扩增DC人们已经能够从小鼠骨髓干细胞扩增出大量DC。

获得长骨骨髓细胞后, Cayeux用加有400 u/ ml GM2CSF (来自基因修饰的NIH23T3细胞系上清) 的RPMI 1640培养基培养混合骨髓细胞中的非黏附细胞, 利用各种细胞的黏附性逐步分离得到较大量的DC 。

Wang则用补体细胞毒方法(低毒的兔补体和单抗混合物作用) 去除小鼠骨髓细胞中的淋巴细胞, 然后置于含重组小鼠GM2CSF 10 ng/ ml和IL24 10 ng/ ml的RPMI 1640全培养基中培养, 6 d后DC的得率为25×106/ 鼠。

赵勇用GM2CSF诱导C57BL/ 6小鼠红白血病细胞FBL23向DC分化, 表达出DC的典型特征。

3 从淋巴液分离DC对淋巴系DC的研究主要集中在动物实验。

6周龄的大鼠行肠系膜淋巴结(MLN) 切除术, 6周后行胸导管置管术,收集淋巴液, 第1次离心1415 %甲泛葡胺, 400 g , 20min) , 可获得40 %～60 %纯度的DC , 再次离心DC的纯度可提高到80 %～90 % , 这可能是获得淋巴系DC的最简捷方法, 难点是大鼠胸导管置管术。

分子杂交筛选出来的MRCOX262 (小鼠单抗) 是对大鼠面纱样细胞(veiled cell) 特异性的单抗, 在大鼠胸腺、脾、颈淋巴结、Payer ‘s结节中都有较多的OX262 + 细胞分布,都呈现出DC的形态, 因此, 这种单抗在分离淋巴系DC中具有重要意义。

需要指出的是在皮肤和小肠还存在一些OX262 + MHC II细胞它们是CD3 +γ/δT细胞, 含量为OX262 +细胞的3 %～4 %。

大鼠骨髓细胞用淘洗法去除塑料平板黏附和黏附细胞, 剩余骨髓细胞置于明胶包被的培养瓶中,用含重组鼠GM2CSF (或同时联用TNF2α) 的RPMI 1640培养基培养, 再次去除未黏附细胞中的Fc + 细胞, 则从3 × 108的混合骨髓细胞可获得313 ×108DC , 都表达OX262分子。

4 从其它组织中分离DC去存在于实体淋巴器官中的DC大部分是淋巴系DC , 这部分DC的分离也都要求将组织制成单个细胞悬液, 通常需要胰酶和/ 或胶原蛋白酶, 将肠黏膜下层(LP) 、Pay ‘er结节(PP) 和肠系膜淋巴结(MLN) 单个细胞悬液置于1415 %甲泛葡胺上2 000 r/ min离心20 min , 得到混合淋巴细胞, 再用E玫瑰花及免疫磁珠T、B及黏附细胞分选出10 %～24 %的LP DC、PP DC和35 %～55 %的MLN DC[16 ] 。

这种方法强调了胶原酶A和0102 %EDTA无Ca2 + 、Mg2 + 的PBS溶液的应用, lens组织滤过也是其特点, 有时需要用到DNA酶。