树突状细胞的分离纯化与鉴定

树突状细胞的分离纯化与鉴定

自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。DC的纯化方法包括两大类: (1) 物理方法:

①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞> DC = 抗体产生细胞> B细胞> T细胞; ②根据细胞的大小比重进行分离, 包括聚蔗糖2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性/ 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。以下就不同组织DC的分离作一综述。

1 从外周血直接分离DC

首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。常用方法有:

(1) Ficoll不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心, 速度(170 g～1 000 g)和时间(20～45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC 分为ER+ 和ER 2细胞,其中ER+ 主要是T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B 细胞、NK细胞和粒细胞, 所得的“新鲜DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到85 %～90 %。如果将ER2细胞培养36 h再加2次各40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏附细胞置于1415 %甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞, 可得到90 %～95 %纯度的“培养DC” (c2DC) 。f2DC和c2DC分别具有未成熟 DC和成熟DC的典型特征。

Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞,

培养36 h去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心, 高密度部分富含B细胞, 低密度部分DC纯度为40 %～80 %Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME) 处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经14-15 %

的甲泛匍胺RPMI 1640溶液(含10 % FCS) 离心, 低密度部分富含DC; 再用免疫磁珠分选出CD14、CD19、CD16、CD3和CD33 + CD14dim细胞, 证实为DC前体细胞, > 90 %表达 CD33 + CD13 +。最近有报道用免疫磁珠连接单抗M2DC8从PBMC中一步分离出一类DC (占血白细胞015 %～1 %) , 其纯度为97 % , 这可能是至今为止最简捷的分离方法。该细胞具有DC的典型特征: 递呈抗原给静息T细胞、诱导MHC I限制性CTL应答, 表达CD86、CD40。与单核细胞相比, 它低水平地表达HLA2DR、CD33、CD45RO , 高水平地表达 CD45RA、CD11c , 它特别高水平地表达FcγR III (CD16) , 使它与单核细胞区别开来。这类细胞与已经确立的一般骨髓源性DC的区别在于表达M2DC8 , 缺少CD83和胞浆内p55抗原, 因此它可能代表中间阶段(intermediate developmental stage) 的DC细胞。

2 从DC前体诱导扩增DC

z从CD34 + 干细胞前体诱导扩增DCCaux用抗CD34 mAb和GAM IgG免疫磁珠、minimacs分离柱从人脐血中获得高纯度的CD34 + HPCs (80 %～99 %) ,将其置于

RPMI 1640全培养基中(加有SCF、GM2CSF和TNF2α及人AB+ 血清) 培养; 5～

6 d后洗去人血清, 用FITC2OKT6 (CD1a) 和PF2leu2M3 (CD14) 单抗标记培养细

胞, 经流式细胞仪分选出CD14 + CD1a和CD14、CD1a + 亚类, 以(1～2)×105/ ml

的浓度接种到含GM2CSF和TNF2α的培养基中再培养6～7 d , 可获得相当数量的

DC , 证实CD34 + 细胞可分化《上海免疫学杂志》2001年第21卷第2期 ©

1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 为两种细胞:

LC型DC和CD14源DC (具有强大的抗原摄取和独特的诱导静息B细胞分化为IgM

分泌细胞的功能)。

Ahuja用Ceprate干细胞收集系统获得CD34 + PBHP (含10 % FBS) 他用改良lscov

‘s DMEM培养基而不用人AB+ 血清, 用干细胞因子SCF (20 ng/ ml) 、GM2CSF

(50 ng/ ml) 、IL2、4和TNF2α (10 ng/ ml) 作为刺激因子, 最终可获得> 99 %的

CD33 + 细胞, 表达多种DC相关表面分子, 混杂的T细胞 (CD34 + ) 、B细胞

(CD19 + ) < 1 %～3 %。 Fujii的方法与Ahuja的方法相似, 他用抗CD34 mAb5612

包被的M2450磁珠从外周血中一步分离出CD34 + HPCs , 经

DETACHaBEADsCD34释放出来后接种到含GM2CSF (100 ng/ ml) 、和TNF2α

(215 ng/ ml) 的培养基中培养, 2 ×105CD34 + HPCs可获得(115 ±012) ×106

CD1a + DC。