基因工程第五章 PCR的技术原理

PCR 技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理，
本章思考题：
1.简述PCR反应的工作原理。 2.循环次数是否越多越好？为何？ 3. 进行PCR引物设计时应注意哪些原则? 4.进行PCR产物克隆的方法主要有哪些？
主要参考资料:
1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版社,2002. 2. J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南(第三版).北京:科学出版社, 2002. 3. F. 奥斯伯等著.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社, 2005. 4. [美] 本杰明∙卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007. 5.何光源主编.植物基因工程实验手册.北京:清华大学出版社,2007
基因工程
第五章 PCR的技术原理
第五章
PCR的技术原理
教学目的和要求:通过本章的学习，要求学生了解利用 达到能够自觉合理地利用 PCR 技术为科研服务，PCR 鉴定和诊断；理解PCR介导的克隆和PCR介导的诱变； 掌握PCR 技术的基本原理、基本操作程序，引物设计方 法。 重点、难点： PCR 技术的基本原理；引物设计方法； PCR介导的克隆。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA 分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散， 变成单链。 变性因素：加热、酸、碱、紫外线等。
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一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时温 度称为熔解温度/解链温度。 一般生理条件下，Tm在85℃ -95℃之间。 影响Tm值的因素： （G+C）含量增加，Tm值增高 溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）； 甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳 定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而 失活）； 若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内. Tm值的计算： Tm = 69.3+0.41(G+C) % Tm = 4(G+C) +2(A+T) （<20bp）
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
复性(renaturation)：变性的两条DNA单链在合适的条 件下，又可按原来的碱基配对，再结合在一起形成双螺旋 构象，又称退火。 复性速度与温度有关，当温度缓慢下降才使其重新配 对复性；若将其迅速冷却至4 ℃以下，则几乎不能发生复 性（可用来保持DNA 的变性状态）。复性的最佳温度为： Tm-5 ℃。 DNA的序列：简单的—复性快； DNA的浓度：高—复性快（分子多、碰撞机会多）； DNA片段的大小：大—复性慢（分子大、运动慢）； 溶液的离子强度：高—复性快（中和DNA分子上的负电 荷，减少两条单链的同性相斥性）； DNA部分复性，复性的速度非常快。
计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了 PCR操作程序，使之迅速得到推广。
PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，巨大的推动作用。
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理 PCR(多聚酶链式反应)是一种体外扩增特异DNA片段 的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板 DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反 应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为 单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿 单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个 循环之后，就可获得大量（106倍）的介于两个引物之间的 特异DNA片段。 PCR技术的特异性取决于引物和模板结合 的特异性。
三、PCR反应
第二节 PCR产物的克隆
一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点
但其连接效率效低。由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，
制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末
端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。在设计引物时，除 了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5’末端添加酶切位点
一、PCR的基本原理
2、 PCR扩增步骤：
①DNA模板的解链（变性） 90 ℃~95 ℃，30s 理论上，在90 ℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链 断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整 性仍能很好保存。 ②DNA 单链与引物的退火（复性） 55 ℃~65 ℃ ，30~45s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望 两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过 模板的量，竞争性结合：引物+模板几率>>DNA自身复性 几率 ）;引物的最佳退火温度Tm-5 ℃，引物的量、引物的 长度。
过长-----易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延 伸温度超过Taq酶的最适温度，同时还使检测成本增加。
(2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55 ℃以上。
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度 不利于提高PCR的特异性；
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
二、PCR反应体系
5、引物（primers) 引物的设计原则 (3)碱基的随机分布： 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或 聚嘧啶的存在。 3’末端最佳选择为G 和C；但不应超过3个 连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 但现在观点认为，在3’端尽可能选用T，少用G或C，这样可 更好的避免假引发。（错配率： T < G或C < A ） (4)引物自身及引物之间不应存在互补序列
一、PCR的基本原理
2、 PCR扩增步骤： ③引物的延伸（新链DNA的合成）70~75℃，30~60s （<2kb) 首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为 人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不 5’ 3’ 一。
第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是 固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端 5’ 3’ 的终止点。
二、PCR反应体系
5、引物（primers)
引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引物与 感兴趣区域一端的一条DNA 模板链互补，另一个引物与 感兴趣区域另一端的另一条 DNA模板链互补。
3’
5’
5’
3’
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到 0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
第一节 PCR技术原理和工作方式
1983年，由Cetus 公司的Kary Mullis 建立； 1988年耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把PCR推 向了实用阶段，成为PCR发展史上又一里程碑； 1989年，美国专利局授予PCR技术专利； 1989年，PCR技术被《science》杂志评选为伟大的技术 发明； 1989年为DNA聚合酶的分子年； 1993年，Mullis 获得诺贝尔化学奖。
二、PCR反应体系
5、引物（primers)
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。具有定 位、定向、定范围的作用。 ①定位 一对引物设计时，分别与一条模板结合，并且是与靶 序列3’端侧翼碱基互补，引物只能结合在所识别链的靶序列 3’端。 ②定向 由于DNA聚合酶的5’→3’合成特点，引物的3’端得以 延伸，两引物延伸方向相对并均指向靶序列中央。
3’ 5’
3’
5 ’
N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限 定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。 P=1-(n+1)/2n
5’
3’
3’
5’
一、PCR的基本原理 2、 PCR扩增步骤： ④循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。 一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产 物中非特异性产物大量增加。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变 成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效 应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物 继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数， 在平台期前结束反应，减少非特异性产物。 通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经 不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增 的DNA 样品稀释103-105 倍作为模板, 重新加入各种反应底 物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
二、PCR反应体系
3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是 PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一般要 有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混 有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增的 效果，一般要求含量合适，3ⅹ105分子数（1μg）（提高产 量，减少非特异性扩增）；
③定范围 引物之间的距离决定了扩增靶序列的大小及特定范 围： 引物A+引物B+AB间序列。
引物设计好坏与PCR结果密切相关。
二、PCR反应体系
5、引物（primers)
引物的设计原则
(1)长度： 16-30bp ，一对引物。
过短-----非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增， 从 而降低扩增的灵敏性；
二、PCR反应体系
1、 缓冲液： 缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应进 行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增的特 异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓度对于 不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, 可以用 0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。 2、脱氧三磷酸核苷 （dNTP） 脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易产 生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四种脱 氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明 显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错 误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。 PCR中常用终浓度为200μM的dNTP
4、DNA聚合酶
选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高保真的酶成本 较高，如果要求严格时选用。Taq DNA聚合酶被看做是低 保真度的聚合酶，因为其缺少3’到5’外切核酸酶（校正）活 性，但是产量高，是目前实验室应用最多的酶。使用带有3' 到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是 这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
引物自身和引物之间不能有连续3个碱基的互补。 引物自身存在互补序列，会使引物自身折叠成发夹结构， 使引物本身复性，这种二级结构会影响引物与模板的复性结 合。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互 补重叠以防止引物二聚体的形成。
二、PCR反应体系
5、引物（primers)
引物的设计原则 (5)引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰： 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影 响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：添加酶切位点；生物素、地高辛、荧光等标记； 引入蛋白质结合DNA序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行，目前使用 最广泛的是Primer Premier 5.0 、Oligo 6、Dnasis、 Omiga、Dnastar。
的序列以及保护序列。
第二节 PCR产物的克隆
二、A/T克隆法
A/T 克隆法是主要针对于Taq DNA 聚合酶扩增的产物。 Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可在 DNA 片段的 3’ 末端添加一个核苷酸，通常为 A(图8-2) 。因此，Taq DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达 到高效克隆的目的。 A PCR产物 T-载体 T 添加T碱基的方法： 用末端转移酶和底物 ddTMP 可以产生单个 T 的突出末端； 有些识别不对称序列的限制性内切酶，在切割 DNA 后可直接 产生一个 3’ 突出的 T ； 用 Taq DNA 聚合酶和高浓度的 dTTP 也可产生 3' 突出的 T .