魔鬼在于细节—CRISPR发展简史(此文很长,笔者多年拜读文献有感)

魔鬼在于细节—CRISPR发展简史（此文很长，笔者多年拜读文献有感）

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美国时间2018年9月10日，美国联邦巡回上诉法院（CAFC）发布了一项重磅裁定，维持美国专利审判与上诉委员会（PTAB）的判决，将CRISPR基因组编辑专利授予隶属于哈佛大学与麻省理工学院的Broad 研究所。美国专利及商标局宣布Broad研究所继续保有2014年获批的CRISPR-Cas9应用专利。2017年2月15日，PTAB曾作出关键裁决，将CRISPR-Cas9基因编辑专利判定给张锋及Broad 研究所。这意味着这项革命性的基因编辑工具的专利之争基本上尘埃落定。

自2012年CRISPR基因编辑技术横空出世以来，各路科研“豪杰”争相应用和发展该技术。随着CRISPR系统趋于成熟，这一技术不再是简单的学术共享，谁拥有革命性基因编辑技术专利权的战争也出现了。打官司的两方是美国加州大学伯克利分校生物学家Jennifer Doudna团队和美国哈佛大学-麻省理工学院Broad 研究所张锋团队。

CRISPR诞生将近6年，其中的发展过程曲曲折折。虽然这项判决再次将Jennifer Doudna团队打入寒冬，但我们心里都清楚CRISPR基因编辑系统发展到今时今日所带来的影响，绝非是一个团队的功劳。每个团队的表现都不可否认，都值得我们尊敬！让我们回顾一下长达6年的CRISPR发展简史！

CRISPR演义

自从CRISPR第一次被证明可以编辑细胞Genomic DNA以来一晃已经快6年了，笔者有幸在这个技术刚出来时就开始追踪和利用，受益匪浅，尤其是得益于张锋实验室的无私贡献，他们把各种最新的质粒几乎是第一时间免费放到Addgene供学术界使用。2013到2015这两年，笔者几乎每一篇CRISPR文章都拜读了，随着时间的流逝，很多细节都不记得了，于是决定重新精读这批经典老文章。随着时间的沉淀，返回去重读时，总是有很多事后诸葛亮的意见。于是兴之所至，决定把自己的心得体会记下来，以免时间长了又遗忘了。

西方有句谚语：魔鬼在于细节，对于生物学研究尤其如此。因此我的随笔都是纠结于细节，希望从细枝末节中看出一些端倪，加上自己的合理想象，猜测那些文章作者背后的想法。事先声明，笔者不认识任何一个做CRISPR的大牛，不知道他们的任何八卦，所以这些想法都是猜测，算不得数，正所谓演义而已。万一不幸被我猜中，也不担负任何泄密之责。

笔者不打算讲CRISPR在细菌里是怎么被发现的，以及一些牛人们是怎么根据DNA序列的相似性而猜出其作用机制的。只从2012年8月Doudna和Charpentier的Science 文章开始谈起（这篇文章其实当年6月份就上线了）。

Science. 2012 Aug 17. PMID: 22745249.

西方科学的精髓就是还原法，对于我们不了解的东西，对它们敲敲打打，拆下一个零件看看

发生了什么；再多加一个零件，看看又发生了什么。然后以此来想象一下它们是怎么工作的。

这就是生物学里的著名的”Loss of Function”和”Gain of Function”。在这里，笔者就不再扯

那些遗传学里的东西了，比如什么筛选突变基因之类的。只是想说由于CRISPR的出现，

使得Loss of function和Gain of Function在哺乳动物里的研究变成非常容易的东西。

书归正传。在介绍这篇文章之前，先介绍几个名词。crRNA, tracrRNA , sgRNA 和PAM。

还别说，前面这俩词，我这个记性不好的人以前是经常忘掉都指的是什么东西。

CRISPR RNA (crRNA)：指的是一个含有42个碱基的小RNA，它的5’是20个可以和目标DNA配对的碱基，所以是可变的；它的3’是22个不变的碱基，术语叫”repeat”。之所以叫”repeat”,大概是因为它在细菌DNA里重复很多次的原因。

trans-activating crRNA (tracrRNA)：指的是一个大概含有87个碱基的小RNA，它的5’可以和crRNA的3’ “repeat”配对，术语叫做”anti-repeat”，除此之外，其它部分可以形成hairpin样的二级结构。这俩RNA结合在一起后可以与Cas9结合，然后通过那20个可变的RNA识别含有PAM的genomic DNA。因为现在最常用的是Cas9，而CRISPR有很多不同的亚类，所以为了不混淆，通常都是写为CRISPR-Cas9。

Single guide RNA (sgRNA)：就是通过4个RNA碱基把crRNA和tracrRNA连接起来成为一个RNA。Doudna和Charpentier率先创造，在in vitro证明可以工作，然后George Church组把它发扬光大，张锋组也笑纳之，并且开发出了另一个可以做CRISPR activation的牛逼东西。此乃后话，暂且不表。

Protospacer Adjacent Motif (PAM)：所谓的protospacer就是指那20个可以被识别的DNA序列，它的后面必须带几个比较特别的碱基，这几个碱基就是PAM。对于Cas9来说就是NGG。Cas9上有一个domain可以识别这个PAM，因为不同的Cas protein识别的PAM不同，所以这个domain在不同的Cas里不保守。

这篇Science文章如何牛逼咱就不提了，因为它会拿炸药奖的。在这里我只讲那些细枝末节和事后诸葛亮的东西。因为这篇文章发表之后半年多，张锋实验室和George Church实验室就率先在哺乳动物细胞里实现了基因编辑，发了两篇Science。而Doudna晚了一小步，做的结果又不是特别漂亮，发了ELife。还有一个陪跑的, MGH的Keith Joung在斑马鱼里实现了基因编辑。

那么Doudna有没有可能率先发表哺乳动物细胞编辑的文章呢？完全可以。她们其实已经手握所有的东西，可惜要么是没有想到，要么是想偏了，竟然放着自己的特长不用，而用质粒来做。这个呆会儿再说。

现在先说说张锋和George Church的两篇文章。很明显，George Church组是在Doudna 和Charpentier的文章的启发下做的，为此他们用了两个牛人一起做，共同贡献第一作者；张锋组也是俩共同贡献第一作者，而Doudna组只有Jinek一个第一作者，加上其他打酱油的（这下明白Doudna组为什么被scoop了吧，我还怀疑她们发了Science后有些懈怠，度假去了）。

George Church组的开篇介绍就是他们看到了Doudna和Charpentier的文章，所以他们要做哺乳动物细胞编辑。而且采用了Doudna和Charpentier率先使用的chimeric gRNA （就是把crRNA and tracrRNA通过4个碱基连接成一个，现在叫sgRNA），幸运的是Church 组用了original tracrRNA sequence，而没有采用Doudna和Charpentier试验过的短一点