血清谷丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)
谷丙转氨酶活力测定
谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。
熟悉转氨酶活性测定的操作方法。
了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。
二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。
参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。
卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。
转氨酶实验前讨论
简便，但-酮戊二酸的干扰使得实验设计上对总体思路 的彻底达成有一定难度。
特异性、精确度高
但，实验条件要原辅酶I在340nm处有最大光吸收，因此伴随 还原辅酶I不断被氧化，340光吸收值随之下降， 下降速率和ALT活力成比例，籍此测定ALT活力。
比色法原理：
速率法原理：
1、以蒸馏水（dH2O）确定722分光光度计的100%T，然后测 定所有实验数据。
2、数据整理：标准曲线各点所获OD值减去丙酮酸含量为零管 的OD值，对应各自丙酮酸含量。 3、标准曲线：以丙酮酸含量为横坐标，以上述求差后的OD值 为纵坐标，按比色法原理要求作图。
4、丙酮酸含量不卡门氏单位的回归分析：以丙酮酸含量和其对 应的卡门氏单位，分析两组数据之间的相关性（可作图辅助自 己判断），利用计算机求算最佳线性拟合，由R方（决定系数） 判断，大于0.999，获得回归方程。
5、样品结果计算：由丙酮酸-OD520标准曲线求得丙酮酸含量， 带入丙酮酸含量不卡门氏单位线性回归方程，求得对应的卡门 氏单位。注意样品各自的稀释倍数。
谷丙转氨酶的测定 （改良赖氏法）
谷-丙转氨酶（ALT），催化 丙氨酸与α-酮戊二酸生成 谷氨酸和丙酮酸：
金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。 其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。 丌同之处在于作用时间： King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。 King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下不底物作用60 min，生成 1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下不底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
两种方法各有很强的优势与不足，而 他们测定的是同一个体系，可否巧妙 的取长补短？
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定-精品文档
【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） 分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如 下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。，要求各S管和U管进行双管平行操
实验七.血清谷丙转氨酶(S-GPT)活性测定
混匀，３７℃水浴预温１０min
2,4-二硝基苯肼溶液
0.1mol/L ＮaOH
0.５
５.0
0.５
５.0
0.５
５.0
混匀，３７℃水浴保温２０min
A520nm波长处比色 计算公式：S-GPT活性单位%= A测/A标×57
三、思考题
以下思考题任选2个作答
1.
什么叫转氨基作用？根据所学理论阐明转氨基作用
实验考试
血清谷丙转氨酶(S-GPT)活性测定
生化与分子生物学教研室
注意事项
1. 2. 3. 4. 5. 6. 考试时间90分钟 血清样品每人一支，并记录编号 移液器及Tip头对应使用，正确操作 登记学号、姓名、血清编号、A测、A标、计算结果及实验报告 的平均成绩 每位同学书写当次实验报告包括思考题，并及时清洗自己所用 的器皿，并将试剂、器皿正确归位 值日生负责当次实验室整体卫生
在蛋白质的合成与分解及糖，脂肪代谢中有何重要
作用？
2. 3. 4. S-GPT活性测定二次保温有什么意义？ 影响酶促反应的因素有那些？ 本实验直接测定物质是什么？
一、实验原理
血清谷丙转氨酶（S-GPT）催化下列反应：
在足量底物条件下，生成产物越多表明酶活性越大，酶浓度越 高。一般以在一定时间内丙酮酸的生成量代表S-GPT活性的大小。
二、实验操作
赖氏法测定S-GPT活力：取干净试管3支，按下表操作： 加入物 测定管 标准管 空白管
谷丙转氨酶底物溶液 血清 丙酮酸标准液（２umol/mL） 0.1mol/L磷酸缓冲液 0.５ 0.1 0.５ 0.１ 0.５ 0.１
血清谷-丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)
将采集的血清样本进行适当的处理，如离心、过滤等，以去 除杂质和分离出血清部分。
实验操作步骤
实验操作
按照实验步骤，逐步进行实验操作，包括加样、反应、比色等。
实验记录
在实验过程中，详细记录实验数据和结果，以便后续的数据分析和处理。
04
结果分析
数据记录
总结词：准确记录
详细描述：在测定过程中，应准确记录每个步骤的数据，包括样本编号、试剂用 量、反应时间、温度等，以确保结果的准确性和可追溯性。
THANKS
感谢观看
05
实验结论
数据总结
实验数据
通过改良赖氏法测定，得到各样本的血清谷-丙转氨 酶活性数据。
数据处理
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、变 异系数等。
数据可靠性
确保实验数据的准确性和可靠性，排除异常值和离群 点。
实验结论
正常参考值范围
根据实验数据，确定正常参考值范围，为临床 诊断提供依据。
结果计算
总结词：科学计算
详细描述：根据实验原理和公式，对实验数据进行科学计算，得出谷-丙转氨酶的活性值。计算过程需注意单位的统一和数值 的精度。
结果解读
总结词：综合分析
详细描述：结合患者病情、肝功能其他指标以及肝功能检查的历史数据，对谷-丙转氨酶活性测定结果 进行综合分析，判断肝脏功能状况，为临床诊断和治疗提供依据。
通过加入溴代十六烷基三甲胺，可以减少反应 液中其他酶对谷丙转氨酶活性测定的干扰，提 高测定结果的准确性。
实验注意事项
实验前应确保血清样本无溶血、黄疸或脂血现象，以免影响测定结果。 实验过程中应严格控制反应温度和时间，以确保反应完全和测定结果的准确性。
在测定过程中应避免接触有毒物质，如重氮基苯磺酸铵等，以免对健康造成危害。
7临床检测--谷丙转氨酶活性的测定(影像中医)
卡门氏单位的定义为： 卡门氏单位的定义为：
在紫外分光光度计中，1ml血清( 在紫外分光光度计中，1ml血清(反应溶液总量为 血清 3ml)在340nm波长下 用内径为1.0cm的比色皿， 波长下， 1.0cm的比色皿 3ml)在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在 25℃， 分钟内生成的丙酮酸 在乳酸脱氢酶催化下， 丙酮酸， 25℃，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下， 变成NAD 光密度下降0.001 0.001为 使NADH+H+变成NAD+，使光密度下降0.001为1个转氨酶 活性单位。 活性单位。 丙氨酸 + α-酮戊二酸 酮戊二酸
酶活性单位定义中必须规定哪些条件? 酶活性单位定义中必须规定哪些条件?
【实验原理】 实验原理】
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的 ）， 条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α 条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的 酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的 生成量，即可计算酶活性的大小。 生成量，即可计算酶活性的大小。
参考值： 参考值： 5~25卡门氏单位 卡门氏单位
实验结果
1. 标准曲线
0 A520nm An-A0
卡门氏单位 0
1
2
3
4
5
28
57
97
150
200
2.血清 血清ALT活性 血清 活性 T C 注：酶活性在97卡门 酶活性在97卡门 97 氏单位以下， 氏单位以下，标本经 稀释后与光密度值的 线性关系良好， 线性关系良好，酶作 用时间较短， 用时间较短，更符合 酶测定要求。 酶测定要求。
实验十五血清ALT测定（赖氏法）
实验十五血清ALT测定（赖氏法）实验十五血清ALT 测定（赖氏法）【目的】1.了解血清ALT 活性测定的原理及测定方法。
2. 掌握血清ALT 活性测定的临床意义。
【原理】丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（ALT ）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。
在反应到达规定时间时，加入2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
后者在碱性条件下显棕红色。
根据颜色的深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。
反应式如下：C H CH 3NH 2COOHCO CH 2CH 2＋ALTCH 3CCOOHO COOHCHNH 2CH 2CH 2＋丙酮酸α-酮戊二酸丙氨酸谷氨酸C CH 3O ＋CH 3CN NO 2NO 2NH 丙酮酸NO 2NO 2NHN H 22，4-二硝基苯肼丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（红棕色）NaOH-H 2O【器材】试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。
耗材：血清，座标纸等。
【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）称取磷酸氢二钠(Na 2HPO 4，AR)11.928g ，磷酸二氢钾(KH 2PO 4，AR)2.176g ，加少量蒸馏水溶解并稀释至1 000ml 。
2. ALT 底物液称取α-酮戊二酸29.2mg ，DL 丙氨酸1.79g 于烧瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后冷却，用1mol/L NaOH调节pH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml，混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数周。
3. 丙酮酸标准液（2μmol/ml）精确称取丙酮酸钠(AR)22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
4. 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10 ml溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。
谷丙转氨酶（ALTGPT）测定程序（赖氏法）
谷丙转氨酶测定程序(赖氏法)一、原理与意义：谷丙转氨酶(ALT/GPT)在37℃及PH7.4条件下，作用于丙氨酸及ɑ-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。
反应30 min后(固定时间)加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即中止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。
苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505 nm测定吸光值并计算酶活力。
根据ALT活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度。
二、试剂及其配制：1.谷丙转氨酶基质液：4 ℃冰箱保存。
2.2,4-二硝基苯肼(DNPH)液：室温避光保存。
3. 4 mol/LNaOH：用时加蒸馏水稀释至0.4 mol/L，室温保存。
4. 2 mol/ml丙酮酸钠标准液，室温保存。
5.0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4 ℃冰箱保存。
三、仪器设备：离心机、7 ml离心管、移液器、分光光度计、玻璃比色杯、水浴锅、玻璃棒、冰箱、烧杯、量筒等。
四、操作步骤：1、血清制备：采集全血，室温放置1～2 h，3000 r×15 min离心取上清，待测。
2、血清ALT的测定：表1 血清ALT的测定加样顺序(ml)测定管对照管血清0.1基质液（37 ℃已预热5 min）0.5 0.5混匀后，37 ℃水浴30 min2，4－二硝基苯肼液0.5 0.5血清0.1混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5混匀,室温放置5 min，505 nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度的差值，查标准曲线，求得相应ALT/GPT活力单位。
五、结果计算与评价表2 标准曲线加样顺序0 1 2 3 4 50.1mol/L磷酸盐缓冲液(ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.102µmol/ml丙酮酸钠标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25谷丙转氨酶基质液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.252，4－二硝基苯肼液(ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5ALT标准曲线图六、注意事项：1.酶活力超过150单位时，用盐水稀释血清后重测。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
血清谷丙转氨酶活性的测定
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
丙转氨酶altalt在在3737生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的24加成反应生成丙酮酸加成反应生成丙酮酸24中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量亦即与围内与丙酮酸的生成量亦即与alt系
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境
中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关
4) 转氨酶只能作用于α －L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对 D－氨基酸无催 化作用。实验室多用α －DL 氨基酸（因较 L－氨基酸价廉），如采用α ―L―氨基酸, 则需按α －DL 氨基酸的用量减半。
5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。
系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或 通过标准曲线查出血清：每毫升血 清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生 成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取 血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清 计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例 如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。
血清谷丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度( 改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度) 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度, 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
【实验原理】 实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃ 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。 标准曲线查出血清中ALT的活性。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 相同。不同之处在于作用时间：King法 Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 min，每生成2.5微克丙酮酸为1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。 卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
2020/3/23
8
标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
二硝基苯肼溶液，氢氧化钠溶液（0.4mol/ L），丙酮酸标准液
（2.0mmol/L ）
连续监测法用试剂盒。
试剂1：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，NADH（0.2mmol/L）， LDH （＞1350U/L）；
试剂2：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，α-酮戊二酸 （50mmol/L），L-丙氨酸（400mmol/L）。
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
仪器等方面的问题。
6、当血清标本酶活力超过150卡门氏单连续监测法）
L-丙氨酸+α-酮戊二酸 丙酮酸+NADH
ALT 丙酮酸+L-谷氨酸
LD L-乳酸+NAD+
在340nm连续监测NADH的消耗量，从而计算出ALT的活力。
2020/3/23
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主要试剂、材料与仪器
改良赖氏法试剂：0.1mol/ L磷酸盐缓冲液、基质缓冲液、2,4-
血清谷丙转氨酶活性的测定
2．GPT底物液
称取分析纯L-丙氨酸1.78g,α-酮戊二酸29.2mg,先用 50mL磷酸盐缓冲液溶解,然后用1mol/L NaOH校正pH 至7.4（约0.5mL）,再加磷酸盐缓冲液至100ml,加氯仿 数滴，防止变质。
3．2.0mmol/L丙酮酸标准液 4．0.4mol/L NaOH溶液 5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液
【实验原理】
ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移,生成丙酮 酸和谷氨酸,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸 2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕色，颜色的深浅与丙酮酸 含量成正比。根据丙酮酸的生成量，即可计算GPT活性的大小。 α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼反应生成相应的苯腙， 在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在520nm处 比色时，丙酮酸2,4-二硝基苯腙的光密度远比α-酮戊二酸苯腙 高。反应30min后， α-酮戊二酸量减少而丙酮酸量增加 ，在 一定范围内，520nm处光密度增加的程度与反应体系中丙酮酸 和α-酮戊二酸的摩尔比例呈线性关系。
【目的要求】
1.了解血清谷丙转氨酶活力单位的定义。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活力测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
GPT酶活力单位
卡门首先研究了GPT酶活力的测定方法，并定义了
酶的活力单位。 原理
活力单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）,在25℃1min中内生成的 丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+,在340nm处， 用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基酸转移酶活 力单位。
【操作步骤】
标准曲线绘制 取试管5支，按下表操作
血清谷丙转氨酶活性的测定
实验内容和步骤
1) 制备标准曲线
2) 绘制标准曲线
以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横 坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对 应的酶活性单位数的标准曲线。
4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L）
称 2，4－二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐 酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。
5) 丙酮酸标准液
精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后 定容至 100mL。此溶液浓度为 2μ mol/mL，临用前 配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸 缓冲液（pH7.4）。
6) 血清转氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定， 其结果应乘以稀释倍数。
7) 每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境
中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关
4) 转氨酶只能作用于α －L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对 D－氨基酸无催 化作用。实验室多用α －DL 氨基酸（因较 L－氨基酸价廉），如采用α ―L―氨基酸, 则需按α －DL 氨基酸的用量减半。
5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。
标曲线血清丙氨酸氨基转移酶测定(赖氏法.
3. 标本的测定 按表2操作。
表二：
对照管 基质液（ul） 样品（ul） 显色剂 50 250 μ L 混合37℃水浴30分钟 250 μ L 样品管 250 50
基质液（ul） 37℃水浴20分钟
稀释氢氧化钠
250
2.5ml 2.5ml
室温放置3min，在波长510nm处，以蒸馏水调零，读取各 管吸光度。
血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）
【实验要求】 掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）的 原理 操作方法及标准曲线的绘制； 了解试剂的配制和临床意义。
【实验原理】
L-丙氨酸与α -酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT，EC 2.6.1.2）催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，加入 2，4-二硝基苯肼终止酶反应，并与丙酮酸生 成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件 下显红棕色，在波长510nm处读取吸光度， 即可计算出丙氨酸氨基转移酶的活性。
【计算】 以空白调零，测定管吸光度减去对照管吸光度 的差值为标本的吸光度，用该值在标准曲线上 查得ALT的卡门单位。 或者以对照管调零，直接读出测定管吸光度值， 用该值在标准曲线上查得ALT的卡门单位。
【参考范围】 0～50卡门单位 【临床意义】 1.血清ALT活性增高可见于下述疾病：（1）肝胆疾病 传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂 肪肝、胆管炎和胆囊炎等；（2）心血管疾病 心肌梗 死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等；（3） 骨骼肌疾病 多发性肌炎、肌营养不良等。 2.一些药物和毒物可引起ALT活性升高 如氯丙嗪、异 烟肼、利福平、奎宁、地巴唑、水杨酸制剂、乙醇、 铅、汞、四氯化碳、有机磷等。停药后ALT活性就可下 降。
血清谷丙转氨酶活性的测定改良赖氏法
试剂二
取0.1mol/L的磷酸缓冲液50mL， 加入0.5%的溴麝香草酚蓝溶液 1.5mL，用0.1mol/L的氢氧化钠 溶液调节pH至7.4，最后加蒸馏 水至100mL。
试剂三
取0.1mol/L的磷酸缓冲液50mL， 加入4%的碳酸氢钠溶液5mL， 用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节
ALT催化反应
在37℃水浴中，将混合液加入含有ALT催化底物的反应体系中，启动催化反应。
NADH消耗检测
通过分光光度计在340nm波长处监测反应体系中NADH的吸光度变化，记录数据。
数据处理与结果计算
根据吸光度变化计算ALT活性，并给出结果报告。
02 实验材料
CHAPTER
试剂准备
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）
实验过程中产生的废液应按照实验室规定正确处理，避免对环境造 成污染。
遵守实验室安全规定
实验人员应严格遵守实验室安全规定，确保实验过程的安全性。
误差控制
保证试剂质量
01
使用高质量的试剂，确保试剂的准确性和稳定性，降低误差。
标准化操作
02
实验人员应遵循标准化操作流程，避免因操作不当引起的误差。
定期校准仪器
用于配制磷酸盐缓冲液，提供反应所需的pH环境。
赖氏试剂（Reitman-Frankel reage…
由NAD+、赖氏酸和缓冲液组成，用于提供反应所需的辅酶和还原剂。
血清样本
用于测定谷丙转氨酶活性，应确保血清中无细菌污染和溶血现象。
仪器设备
分光光度计
用于测定反应过程中吸 光度的变化，进而计算 酶活性。
恒温水浴
用于维持反应温度，通 常设定在37°C。
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验十九 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙 （红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。
【试剂】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。
每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。
配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。
若有结晶析出，应重新配制。
6．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。
7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。
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【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） 分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如 下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。
血清谷—丙转氨酶活性的 测定（改良赖氏法）
【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【实验原理（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操
作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。
【实验结果】 1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 在 坐标纸上以上表中An－A 0之值为纵坐标，相应的 酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法 测定ALT的标准曲线 2.标本中ALT活性结果 ⑴查标准曲线 利用测定所得的吸光度结果(AU－ AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 ⑵计算 将实验测得的AU－AB 、AS 代入下面计 算公式，即可算得标本中ALT活性
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
【临床意义】 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。 【思考题】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 避免溶血？