死活细胞的鉴别

（一）、死活细胞的鉴别

生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微

镜来观察。

染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方

法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未

经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。

所用染料的分类：

一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染

料才能进入细胞膜。

第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易

穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加0.1ml 染液，2

分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)：

0.05%的苯胺黑以1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。

③伊红Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。

第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯

胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一

特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构

专一性的结合。

①1%结晶紫染色生理

1%结晶紫盐水与细胞悬液1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成

蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变

化，基本上不影响细胞的生命活动。

②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。

丫啶橙是一种与DNA 和RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发

下，DNA 可激发出530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出640nm 的荧光发射峰，

它与双链DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸

引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质RNA

Page 9发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散

布在细胞质中的RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物

质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合

在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主

要显示出的是DNA 和RNA 两种核酸。

本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。

（二）细胞核和染色体的染色

Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。

醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质

丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有

丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的KCI 低渗5-10 分钟，使细胞膨胀，染色

体分裂；甲醇固定10 分钟，空气干燥，滴加2%醋酸地衣红，染10-20 分钟后即

可观察。

（三）细胞器的特殊染色

1、内质网的显示

早在1945 年，有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞的内质网。之

后，观察内质网基本是采用电子显微镜。在80 年代中开始发展了一些活细胞荧

光染料，又称“荧光探针”，为显示细胞内的模型结构，包括内质网，提供了新

的途径。

DiOC6(3):是一种亲脂性的阳离子荧光染料，可选择性的与负电性的膜结构

结合。在低浓度时仅能染出线粒体，细胞界限不清，较高浓度时（0.5-2.5μg/ml）

内质网染色最佳，而容媒体、高尔基体等均然浅色。

2、高尔基体的显示

在光镜下观察高尔基体可用景点的固定染色，也可用活细胞荧光染料。由于高尔

基参与分泌这一动态过程，对糖蛋白、糖脂进行加工、分选和运输，所以在活细

胞中研究其动态和三维结构具有重要的意义。

Baker 苏丹黑染色法：可用于组织块、体外培养的单层细胞的染色。染色结

果：高尔基体呈黑色囊泡，细胞核呈红色。

Page 10活细胞中高尔基体染色：用荧光探针NBD-hexanoic ceramide 进行染色。

溶酶体的显示：观察溶酶体可以用电子显微镜，也可以采用细胞化学的方

法来现实。比如，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。这部分内容在下学期讲。

3、线粒体的显示

线粒体（mitochondrin）:是细胞内一个极为重要的细胞器，是细胞内物质

氧化磷酸化产生能量的重要结构。

线粒体的形态结构和功能定位

光镜：多为粒状、杆状、线状。不同的细胞类型，不同的生理状况，其形

态大小也有所不同。

电镜：是由二层单位膜围成的膜性囊，

⑴．外膜与内膜不连接。

⑵．内膜是皱褶的。

⑶．内膜表面不光化的膜结构向内凹陷，形成嵴。

⑷．嵴上有基体微粒（上面有ATP 酶，是偶联磷酸化的关键装置）。

⑸．嵴间为基质，含蛋白质、脂类、DNA、RNA 和核

蛋白体。有关催化线粒体内各种生命活大过程所需的酶和辅酶，都分布在线粒体

的基质中。

细胞生命活动中需要的大约95%的能量来自线粒体。所以说线粒体是一个重

要的细胞器。细胞的内外环境因素的改变，可引起线粒体结构和功能的异常。发

现和检查线粒体就显得十分重要了。但线粒体在动物死后极易产生变化，故取材

必须新鲜。

实验三健那绿染活细胞线粒体

原理：健那绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，

能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜

上。内膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色。而在胞质内染料