叶绿体的荧光染色与观察

姓名班级 13级生命基地班学号同组者：
科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察
【实验题目】
叶绿体的分离与荧光观察
【实验目的】
1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光
3、熟悉荧光显微镜的使用方法。

【实验材料与用品】
1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管
六层纱布，载玻片、盖玻片等
2. 材料：新鲜菠菜
3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)
【实验原理】
I.叶绿体分离的原理
匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。

差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。

依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要
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迅速分离和观察。

II.差速离心
特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；
用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；
沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。

III.①荧光的概念
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。

紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。

荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。

荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。

某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光（直接荧光)，某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样的荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出桔红色荧光。

②荧光的性质
1）吸收光，必须有激发光源
2）荧光波长＞激发波长（损失热能）
3）荧光强度极小于激发光的强度
4）有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等；先拍照后观察）
5）荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油）
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吖啶橙（AO）
1）探针特性：吖啶橙是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。

2）AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。

3）强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在核酸双链的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合的更加稳定。

每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子的插入数目，每隔三个碱基插入一个AO分子。

这种方式的结合，主要是AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm,呈绿色荧光。

4）弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1.这种结合方式主要是AO分子与RNA的结合，其发射波长为640nm,呈红色荧光。

5）AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性强结合方式占优势。

④ AO的主要作用
1）对细胞内单链或双链RNA或DNA定性和定量
2）分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象
3）观察DNA凝胶电泳情况
4）作为胞内PH梯度显示剂，用来监测钠离子交换、钙离子诱导的质子梯度变化等。

IV. 荧光显微镜的操作及注意事项
1) 接通电源，打开启动装置开关；
2) 按starter按钮3-5秒以启动激发光源。

注意starter键不能超过5秒。

启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch；
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3) 光路对中（换灯泡时进行）；
4）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。

5）放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野；
6) 关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察到样品的萤光情况
7）需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片；
8) 观察结束后，关闭main switch，切断电源。

【实验步骤】
一、具体操作
1.选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中；
2.将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机中），匀浆3-5min，转速5000r/min；
3.将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中；
4.将滤液4ml在1000r/min下离心2min；
5.取上清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；
6.将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮；
7.取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；
8.另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

9.取干净的菠菜叶子的下表皮的薄薄的一层几乎透明的一层做成装片进行观察，在普通显微镜以及荧光显微镜下分别观察气孔、保卫细胞等；
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【实验结果与分析】
I .实验结果
图1：普通光学显微镜下观察到的叶绿体（10*40）
图
2：局部放大图 图3：荧光显微镜下的未染色叶绿体 图
4：荧光显微镜下染色的叶绿体
图中圆形或椭圆形绿色颗粒状物质即为
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图5:荧光显微镜下的保卫细胞
II. 实验分析
普通光学显微镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

另外还有一些其他组织碎片，可能是在离心时，和叶绿体差不多大小的细胞核破碎物一同被离心下来；
荧光显微镜下未经吖啶橙染色的叶绿体，自发出火红色荧光，呈斑状点状分布在视野中，背景为黑色；叶绿体经激发光波照射后，自发荧光呈现火红色，悬液其他组分无自发荧光反应，且叶绿体在其悬液中呈现点状均匀分布，故观察到斑状分布的火红色荧光效果。

经吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察，叶绿体呈橙黄色，叶绿体悬液中混有的细胞核碎片中的核酸经丫啶橙染色荧光反应呈现绿色；因载玻片材质问题，在荧光显微镜下也发出荧
光，在一定程度上影响了实验观察，因此在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片和无荧光盖玻片，这样背景呈黑色，叶绿体为橙黄色，细胞核碎片为绿色，效果会更加明显。

气孔两旁为保卫细胞，在荧光
显微镜下，可看到气孔的保卫
细胞呈肾形（含有叶绿体，自
发荧光），保卫细胞周围的表
皮细胞则不含叶绿体
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【注意事项】
1. 应选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，用组织捣碎机进行破碎；
2. 差速离心时要控制好离心的速度和时间，否则会影响叶绿体的分离，可能最终会无法观察到叶绿体；
3. 差速离心只能得到80%纯度的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心法；
4. 差速离心分离出的叶绿体中含有部分细胞核碎片，在荧光显微镜下观察时注意区分；5．注意荧光显微镜的操作方法和注意事项，切勿损坏仪器。

6. 离心结束后，用0.35%的氯化钠溶液悬浮，要保证充分混匀，避免沉淀堆积，影响对单个叶绿体的形态观察；
7. 制片时，注意所取的悬液应适量，保证视野的叶绿体的数量适宜；
8. 要得到完整的、有活性的叶绿体，须在低温下迅速提取，涂片后立即观察；
9. 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察，会受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等，因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应先拍照，后观察；
10. 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、无荧光盖玻片，以避免载玻片等发出的荧光影响观察；。