使用顺铂治疗肝癌患者疗效观察

浅析使用顺铂治疗肝癌患者的疗效观察
【摘要】目的：通过对肝癌患者使用顺铂治疗后，观察肝脏癌细胞凋亡情况，探讨对肝癌患者手术治疗前实施化疗的必要性。

方法：对手术切下的肝脏肿瘤组织制成细胞悬液进行荧光染色，用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

结果：经顺铂治疗的病人较对照组的癌细胞细胞增殖指数显著降低，癌细胞凋亡率显著提高，而细胞增殖指数显著降低。

结论：小剂量cddp诱导治疗肝癌，作为综合治疗肝癌方法的一种是可行的，特别是在外科治疗（肿瘤切除或减低肿瘤负荷）前，作为辅助治疗能防治肿瘤的复发和转移。

【关键词】肿瘤；铂类抗癌药物；细胞凋亡
肝癌等恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的主要疾病。

铂类药物—顺铂已成为恶性肿瘤的主要化疗药物之一。

顺铂是顺二氯二氨合铂（ⅱ）的简称，缩写为ddp或者cddp（ⅱ），体外实验已证实[1]，顺铂（cddp）能够诱导肝癌细胞（hcc）凋亡的发生。

其人体内作用如何，目前研究较少，而本次实验就是针对顺铂的体内作用所做的研究，从而将药物的作用与临床效用结合起来。

1 材料与方法
1.1药品准备
（1）顺铂（cddp）：规格为辽卫药准字（1996）第001796号（锦州制药一厂）。

（2）pi染色应用液
（3）10倍pbs
（4）小牛血清：杭州四季青生物制品工程公司产品。

1.2标本来源
肿瘤科2006年11月至2007年3月收治的肝癌患者20例，随机分为两组。

cddp 治疗组10例，行手术前cddp诱导治疗：20mg/d，连续4天，2天后行手术治疗。

对照组10例，未予任何术前治疗，常规行手术治疗。

1.3 标本制备
取肿瘤组织50—100mg，机械法分离制成单细胞悬液，经尼龙网（300目/寸）过滤；离心（1500r/min）5分钟，弃上清；pbs清洗一遍，加入0.5ml75%乙醇固定1h，每管加入30-50μm 小牛血清（目的是使细胞和血清共沉淀，如果不加血清，固定后的离心速度要使用6000r/min，这样高的转速可能增多细胞碎片，影响流式检测的结果）， 3000rpm，5min，4℃离心，弃上清液，加入0.01%rna 酶4℃静置10分钟；pbs洗涤两次后，3000rpm、5min、4℃离心弃上清，加0.005%pi1ml对细胞核dna染色；调整细胞数至1×106
个/ml，4℃下避光静置30分钟后上机检测。

pi（碘化丙锭）染色法原理：pi，即碘化丙锭，可以与细胞内dna 和rna结合，采用rna抑制剂将rna消化后，通过流式细胞术检测到的与dna结合的pi的荧光强度直接反映了细胞内dna含量的多少。

由于细胞周期各时相的dna含量不同，通常正常细胞的g1/go 期具有二倍体细胞的dna含量（2n），而g2/m期具有四倍体细胞的dna含量（4n），而s期的dna含量介于二倍体和四倍体之间。

因此，
通过流式细胞术pi染色法对细胞内dna含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为g1/go期，s期和g2/m期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

值得注意的是，pi不能通过细胞膜完整的细胞（如活细胞和早期凋亡细胞），在标本制备时，必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性，才能使pi进入细胞内与细胞内的核酸结合[5]。

乙醇通常为终浓度为 70% 的冷乙醇。

1.5 方法
1.5.1 荧光染色观察细胞核形态结构
将上述机械法分离制成单细胞悬液，pbs洗2次，悬浮于适量含8ug/mlhoechst33342的pbs中，室温下避光染色15min，pbs洗2次，滴片后于荧光显微镜（bh2，olympus）下观察细胞核形态，以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚、凋亡小体形成和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征。

为区别细胞凋亡与坏死，取部分细胞于
100ug/ml碘化丙锭（pi）及0.8ug/mlhoechst33342中同上避光染色15min，pbs洗2次，滴片观察，以pi着色细胞为坏死细胞。

1.5.2透射电镜观察凋亡细胞的超微结构变化
药物作用36h后收集细胞，pbs洗2次，以2.5%戊二醛、1%饿酸双固定，用epon812常规方法包埋，制成半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下定位。

lkb5型超薄切片机切片，铀-铅双染色，透射电镜（jem- 200ex，jeol）下观察。

1.5.3直接免疫荧光法流式细胞术检测细胞凋亡
搜集1×106个细胞，pbs洗2次，移入玻璃管，200g离心6min
（室温），药物作用一定时间后弃上清，加100μg/ml毛地黄皂苷（digitonin）100ul，冰浴20min，加2ml冰pbsf
（pbs/2.5%fcs/0.01%nan3），2000r/min离心6min（室温），弃上清，加藻红素（r phycoerythrin）标记的apo2.7单抗（apo2.7pecy5）20μl和pbsf80μl，避光染色15min（室温），加2mlpbsf，2000r/min 离心6min（室温），弃上清，加1mlpbsf，于美国库尔特episxl型流式细胞仪上进行荧光强度测定（激发488nm，发射670nm），每次测定5000个细胞，并给出相应的凋亡百分率。

2 结果
2.1 hcc细胞凋亡情况的定性观察
荧光显微镜下，正常细胞染色质均匀，核形态规则。

而cddp化疗组的细胞可见较多凋亡细胞，形态上有以下特点：细胞体积缩小，染色质凝集，核固缩，出现凋亡小体，绒毛消失，异染色质边集于核膜处，分界不清。

运用统计学方法satterthwaite 近似法对这两组标本进行t检验：ppi标准差计算为：sc=4.49 sd=9.25，p<0.05，可认为两组数据方差不等，运用统计学方法satterthwaite 近似法对这两组标本进行t检验：p<0.05，在α=0.05 水平上拒绝h0，所以可认为经cddp治疗的病人（c组）较对照组（d组）的癌细胞pi显著降低。

癌细胞凋亡率显著提高，而pi显著降低，提示诱导细胞凋亡发生是cddp对肿瘤细胞抑制作用的主要方式。

3 讨论
细胞凋亡（apoptosis）是由于内外环境变化或死亡信号触发，在相关基因调控下引起的细胞主动死亡过程，在生理状态下能消除集体内老化细胞及潜在性的异常生长细胞，对于保持集体稳态发挥重要作用。

凋亡调控失调可引起人体多种疾病，也是肿瘤发生的重要原因之一，近年研究也发现放化疗等多种抗肿瘤治疗的部分机制与诱导凋亡有关[3]。

由于细胞的坏死与凋亡的最终结果极为相似，所以在实验的数据中要注意坏死与凋亡的差别：坏死[4]（necrosis）是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化缓慢、dna降解不充分，引起局部严重的炎症反应；凋亡是细胞对环境的生理病理性刺激信号、环境条件的变化或者缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。

其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。

通过本研究分析，作者认为肝癌的化疗是有效的，关键在于减少副作用，使治疗得以持续进行。

既往化疗强调大剂量，往往副作用较大；近年来认识到化疗药物能通过诱导凋亡而起作用，使人们对用药的方式有了改变。

小剂量、持续化疗的方法已开始运用。

近期国外文献[19]已有报道用小剂量cddp和5-fu治疗多灶性复发性肝癌和消化道肿瘤，并收到较好的效果。

在本研究中，临床观察cddp 诱导治疗患者无明显副作用发生，术后肝功能恢复与对照组无明显差异。

所以笔者认为，小剂量cddp诱导治疗肝癌，作为综合治疗肝癌方法的一种是可行的，特别是在外科治疗（肿瘤切除或减低肿
瘤负荷）后，作为辅助治疗能防治肿瘤的复发和转移，具体的治疗方法尚有待进一步探讨。

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