实验_金黄色葡萄球菌的分离和鉴定

鸡蛋卵清芽孢杆菌的分离和鉴定

专业：11生技姓名：张媛梦学号：201111001086

摘要：芽孢杆菌，细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。

关键字：芽孢杆菌分离纯化革兰氏染色

1、实验原理

1.1芽孢杆菌的分离：

芽孢杆菌无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。所以，在微量的磺胺药物的环境中依然可以繁殖。芽孢是芽孢杆菌特有的结构，其主要特点是抗性强，对高湍、紫外线、干燥、辐射等有毒化学物质有较强的抵抗力。

1.2芽孢杆菌的革兰氏染色：

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G－）两种类型，这是由于这两种细菌细胞壁结构和组合的差异所决定。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏染色细菌细胞壁含糖量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加原先滞留下来的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又复变为染色剂颜色。

2、实验材料和设备

2.1.培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.75g，蛋白胨2.5g，氯化钠1.25g，琼脂3.75g，蒸馏水250ml，PH7.0-7.2 121℃灭菌20min后倒平板。

2.2试剂

磺胺类药物、革兰氏染液

2.3仪器和设备

生鸡蛋、显微镜、培养皿、锥形瓶、移液器、灭菌锅、培养箱、离心机、试管、载玻片、接菌环。

3、实验方法

3.1芽孢杆菌的分离：

1.配制培养基、50ml蒸馏水30min高温高压灭菌。

2.取鸡卵清，加入少量蒸馏水配置成悬液，加入磺胺类药物200μl，取5ml 悬液在无菌条件下放入灭菌的离心管中离心，取上清液2000r/min 15min 取上清液离心3次。

3.从离心管中取5ml上清液加入50ml无菌水中，30℃培养24h。

4.取培养好的菌液，按梯度稀释法稀释土壤悬液，依次制备成100、1000、10000、100000倍悬液后，分别取200ul涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于37℃培养箱中培养48h。

5.挑出培养最优势的菌种，在干净培养基平板划线并置于37℃培养箱中培养48h，进行分离纯化。

6.挑选出分离纯化好的菌种置于试管中进行大量培养。

3.2芽孢杆菌的革兰氏染色：

1.取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥和固定。

2.滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min后倾去染液，水洗至

流出水无色。

3.先用卢戈氏碘液冲去残留水剂，再用碘液覆盖1min,倾去碘液，水洗至流

出水无色。

4.再用碘液用吸水纸吸取，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色，当流出

液无色时立即用水洗去。

5.将玻片上残留用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水

晾干。

4、实验结果

4.1 芽孢杆菌的分离与纯化

由于在卵黄中已加入磺胺类药物并离心三次，所以在培养基中以37℃培养48h可培养出大量菌体，而且较为纯净。

48h后培养的菌体得出结果，稀释涂布的菌液生长的较好的是10∧（﹣5）的菌液。

4.2芽孢杆菌的革兰氏染色：

经过革兰氏染色该芽孢杆菌染色为蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

由于芽孢杆菌两种细菌的脱色效果不同，细胞壁含糖量高，肽聚糖内部结构滞留碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。