二)液相色谱方法建立和优化

39
流动相极性
40
流动相洗脱强度
反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 水< 甲醇<乙腈< 乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”
正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
**应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法
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流动相的选择原则

理想的HPLC检测器



高灵敏度；可忽略基线噪音 宽的线性范围 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
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灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音 的比值（S/N） 6:1 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 S 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性
2）可用于梯度洗脱
3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质
23
吸光度（ UV/Vis）检测的应用
大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测 定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的 检测器
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检 测器，25%是PDA）

HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极 性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质 的分离和分析并且可以做制备

在医药、食品、农业、生命科学、化工 、环保等领域都有着广泛的应用潜力。
5
HPLC的应用领域

在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
碳水化合物
脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸

3 3
多环芳烃（PAH）
CH3 CH3
OH
3
维生素
O
O
O H3C NH Oห้องสมุดไป่ตู้O CH3
O
O
O
CH3
O
CH3
29
氨基甲酸酯类杀虫剂
示差折光（Refractive Index）检 测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色 谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中 与真空中的速度之比值
9
二.方法开发的过程
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认
Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2

N
21
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求
22
吸光度（ UV/Vis）检测原理
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速不敏感
6
8
10
4.
不同类型色谱选择性差异
Acclaim C18
3 2 1 温度: 流速: 进样量: 检测: 5 6 峰: 1. 尿嘧啶 2. 嘧啶 3. 苯酚 5. 甲苯 7.5 μg/mL 50 50 60 50 4 6 5 色谱柱: 规格: 流动相: 如色谱图, 5-µm 150 mm x 4.6 mm CH3CN/25 mmol/L 磷酸盐, pH 3.3 (60/40 v/v) 30ºC 1 mL/min 5 µL UV, 206 nm
17
梯
1）选择HPLC检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应 流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的 变化作出响应（通用型）
食品添加剂
酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素〕
维生素
污染物
霉菌（黄曲霉毒素〕 农药残留和兽药残留
6
多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
HPLC的应用领域

在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血 管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性 激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素 、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮 甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青 霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
Acclaim 120 5 µ m C18 1 品牌 B 1 品牌 A 1 2 2. 3 4 3. 2 3 4 2 3 4 Column: Eluant: Flow rate: Temperature: Peaks: 如图所示 90% MeOH 1 mL/min 30 ºC 1.
0
37
2
4 Minutes
24
光电二极管矩阵（Photo Diode Array）
Photo Diode Array
简称：PDA或DAD
25
光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途
一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能 -色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合



灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
12
分离(制备)时要了解哪方面的情况 ？



要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?
一个完整的方法举例
色 谱 柱 Acclaim PA C16，120A，4.6 *150 mm *5 μ m (S/N 00148) at 30 ºC 25 mM KH2PO4，pH 3.5 (用5% H3PO4调节) ACN 1.0 mL/min
流动相A 流动相B 流 速 进 样 量
检测波长 210 nm 5 μL Time (min) 18.0 0 15.0 17.0 17.5

S R
30
示差折光（RI ）检测 的原
理
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感
2）不能用于梯度检测
3）灵敏度低，ug级检测
返回
31
示差检测器的应用
示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合 适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测 特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如 糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化

运行程序
梯度方法 等度方法
15
液相色谱实验所需的基本参数

液相色谱实验所需的基本参数 • 流动相：种类及配比，等度或梯度
• 固定相：色谱柱类型及内径、长短
• 流动相输送系统参数：流速
• 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等
• 温度控制 • 进样量

16
以上参数即构成一个具体的HPLC方法，亦称 色谱条件
26
荧光（Fluorescence）检测原理

原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS） 使其分子达到激发态，当其返回到基态时发 射光的现象即荧光


优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测
缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需 要衍生
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荧光检测器原理
28
荧光检测器的应用
环境中的污染物 多环芳烃(PAH)， 多酚，氨基甲酸酯 H C CH 等 食品、饮料 CH 食品中的毒素； 例如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨 基酸 生物技术及制药 黄曲霉毒素
AU
4
Acclaim PA2 3
1 2
4. N,N-二甲基苯胺 50
0
38
2
4 Minutes
6
8
10 6. 4-丁基苯甲酸
3）反相色谱及流动相

反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离
反相色谱的固定相（填料）为非极性，流动相为 极性。用得最多，约占60-70% 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱
10
第一步干什么?
想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似 样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA--仪器制造商的文献，如Dionex,Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品

11
分析时要了解哪方面的情况？
32
2）色谱柱选择
色谱柱类型 C18、C8、苯基、内嵌极性基团等 硅胶、氨基柱、氰基、乙二醇柱等 特殊色谱柱：手性色谱柱、凝胶柱、离子交 换柱等 规格 长度、内径、粒径、孔径等 品牌、批号 Acclaim系列、Zorbax系列、Atlantis系列 、国产色谱柱等

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不同品牌C18区别


样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收 * 黏度低，流动性好 * 无毒或低毒，易于操作 易于从其中回收样品 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境
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常用流动相
反相体系 有机相：ACN、MeOH等 水相：H2O、磷酸缓冲盐(pH2、7、12)、醋酸 缓冲盐(pH4.5)、硼酸缓冲盐(pH9、13)、三 羟甲基氨基甲烷(Tris，pH8)等 改性剂：三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)等 正相体系 正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等 乙醇、异丙醇等
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HPLC的应用领域

化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等； 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等 在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、 酚类、胺类和二恶瑛的检测
在无机离子分析中应用 –饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
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使用文献方法注意点


色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）
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一个完整的方法包括

流动相类型 色谱柱及柱温 流速 检测器 进样量
戴安中国HPLC用户培训 2009年
戴安中国有限公司
液相色谱的应用以及方法开发
戴安中国有限公司
一.HPLC的广泛应用

据2004年统计，世界上化合物总数多 达4700多万种 在全部有机化合物中仅有20％左右的 样品适用于GC分析


而HPLC可对80％左右的有机化合物进 行分离和分析
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HPLC的广泛应用

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选择液相色谱的检测器
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性
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RI ug 104 是 是 否 ABS ng 105 否 否 否
ELSD ng 否 否 否 是 FL pg 103 否 否 否
MS pg 103 是 否 是 EC fg 106 是 是 是 Cond pg 105 是 是 否 MS pg 103 是 是 是
在兽药研究中分析应用
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HPLC的应用领域

在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)

在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品