第十四章临床化学常用分析技术 (1)

第十四章临床化学常用分析技术

本章考点

1.临床化学常用分析方法

光谱分析、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分析技术的基本原理和应用

2.临床化学方法的建立

（1）方法建立的根据

（2）方法建立的过程

（3）方法的评价

（4）方法建立后的临床观察

第一节临床化学常用分析方法

一、光谱分析（分光光度技术）

定义：

利用物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。

它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技术。

分类：

（一）可见及紫外分光光度法

分光光度法的理论基础是朗伯－比尔定律。

mber－Beer定律：

A = k·b·c

A为吸光度

k——吸光系数

b——光径，单位：cm。

c——溶液浓度，单位：g／L

在可见-紫外分光光度法中，通常在测定未知样品浓度的同时，与同一个已知浓度的标准物作比较，可以利用以下公式计算而求出其浓度,即比较法。

其中C

x 和A

x

为标本管浓度和吸光度，C

s

和A

s

分别为标准管浓度和吸光度。

2.摩尔吸光系数：在公式“A=k·b·c”中，当c=1 mol／L，b=1cm时，则常数k可用ε表示称摩尔吸光系数。

ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。

ε是物质的特征性常数。

不同物质的摩尔吸光系数不同

3.比吸光系数：在公式“A=k·b·c”中，当c为百分浓度（w／v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。

（二）原子吸收分光光度法

根据待测元素的气态原子能吸收相同原子所发射的特定波长的光，其吸收特性遵循Lambert-Beer定律，即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。

常用的定量方法有：

1.标准曲线法：

将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。

2.标准加入法：

纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。

本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响。

3.内标法：

在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。

本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。只适用于双通道型原子吸收分光光度计。

（三）荧光分析法

有些物质物质受到有较高能量的光（如紫外光）照射时，在吸收了某些波长的光后，会发射出不同波长和不同强度的光（光致发光），照射停止，发光亦随之消失，这种光称为荧光。

利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。

在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。

荧光分析法测定的是受光激发后所发射的荧光强弱。

在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强。

（四）火焰光度法（火焰发射光谱法）

是待测元素利用火焰作为激发源，成为激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法，属于原子发射光谱分析的一种。

样品中待测元素激发态原子的发射光强度I与该元素浓度C呈正比关系，即I=aC，式中a为常数，与样品组成、蒸发和激发过程有关。

火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。

临床工作中，火焰光度法主要用于体液中的钠、钾测定，钠的特征谱线为589nm（黄色），钾的特征谱线为767nm（深红色）。

（五）透射和散射光谱分析法

主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度，常用法为比浊法，又可称为透射比浊法和散射比浊法。

临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。

二、电泳分析

在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。

常用的电泳分析方法：

1.醋酸纤维素薄膜电泳：

醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。

这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出现的“托尾”现象。

具有分离速度快、样品用量小的特点。适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

2.凝胶电泳：

以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核酸。

琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。

3.等电聚焦电泳：

利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，在区带电泳中分辨率最好。

常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。

4.毛细管电泳：

利用电泳和电渗流的电动力学原理，在一种空芯的微小内径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。

毛细管电泳可分为：毛细管自由溶液区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳及胶束毛细管电动力学色谱。

三、离心技术

（一）离心技术的基本原理

离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。

离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。

制备离心技术主要用于物质的分离、纯化，而分析离心技术主要用来分析样品的组成。

m是质量（g）

ω是旋转角速度（弧度／s）

X是颗粒离开旋转中心的距离（cm）

相对离心力（RCF）：RCF=1.118×1O-5·n·X

n为转子的转数（rpm）

X为离心转子的半径距离（cm）

（二）离心技术种类及在检验中的应用

1. 离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：

①对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等；

②分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。

2.种类：

（1）普通离心法：

可用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。

（2）差速离心法（差级离心法）：

原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。

3.密度梯度离心法：

比差速离心法复杂，但该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。

其做法是将样品放在密度梯度介质中进行离心。可分为：

1）速率区带离心法：

根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。