【CN110208226A】一种高度特异性的单分子荧光检测方法【专利】
【CN109852670A】一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910160705.2(22)申请日 2019.03.04(71)申请人 中国医科大学地址 110122 辽宁省沈阳市沈北新区蒲河路77号(72)发明人 张斌 关一夫 袁莹 李硕 (74)专利代理机构 沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人 史力伏(51)Int.Cl.C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01)(54)发明名称一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法(57)摘要本发明涉及基础研究（基因表达调控、生物进化、种属鉴定、基因分型）和应用研究（药物开发、法医鉴定、食药品安全监管、海关检验检疫等）领域中的高特异性核酸检测，具体涉及到一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法。
该检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。
本发明的高特异性核酸检测试剂操作简便、快速便捷、性价比高，可以满足自动化的需要，省时省力，便于实现规模化实验和基础研究。
权利要求书1页 说明书8页序列表2页 附图5页CN 109852670 A 2019.06.07C N 109852670A1.一种高特异性核酸检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。
2.一种高特异性核酸检测试剂的使用方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一：将特异性探针①与含有待检测的核酸链②加入到反应缓冲液中，进行变性退火；步骤二：将单链核酸酶加入到反应缓冲液中，在优化温度下孵育特定时间，其优化温度取决于特异性探针的探针长度、构成特异性探针的核苷酸组分与类型、以及单链核酸酶的最适工作温度；其反应时间取决于单链核酸酶的酶切效率；步骤三：反应结束后，将反应体系在95℃孵育20分钟；步骤四：将反应体系自然降温到室温；步骤五：将单链核酸酶处理过的反应体系进行核酸检测。
一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用[发明专利]
![一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/12ef2f80011ca300a7c390c0.png)
专利名称：一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用
专利类型：发明专利
发明人：梁思成,李昊,刘增金,吕沐瀚,吴建明,齐晓怡,邓明明申请号：CN201811573240.5
申请日：20181221
公开号：CN109705110A
公开日：
20190503
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用，所述荧光探针为3‑苯并噻唑基‑香豆素‑7‑酚酯类衍生物；采用荧光探针作为GSH的特异性探针，所述荧光探针的酯键可以识别GSH中巯基基团，生成具有荧光属性的取代物，为off‑on型荧光反应。
本发明将香豆素与苯并噻唑连接作为一种新型的荧光探针，通过荧光的产生与淬灭实现检测，具有较高的检测灵敏度。
本发明提供的荧光探针的细胞毒性小，所述荧光探针的结构以香豆素作为母核，对细胞的毒性作用较小，且具有良好的生物相容性，可广泛应用于活细胞、组织体内。
本发明中荧光探针的检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中GSH的定量测定。
申请人：西南医科大学附属医院
地址：646000 四川省泸州市江阳区太平街25号
国籍：CN
代理机构：成都君合集专利代理事务所(普通合伙)
代理人：张鸣洁
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一种高精度的荧光单分子纳米级定位算法
一种高精度的荧光单分子纳米级定位算法鄢志丹1,2，孙立东2，李艳宁1，胡小唐1，ZEPPENFELD Peter2【摘要】荧光成像系统的技术指标、采集的荧光图像信噪比和单分子定位算法是影响单分子定位精度的3大因素.在介绍单分子定位的基本极限精度和理论计算精度的基础上，提出了一种被称为图像去噪高斯掩膜算法的单分子定位算法.依据实验用单分子成像系统的具体配置，通过计算机仿真表明，该算法良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，不仅能实现纳米级的定位精度，而且能突破一般理论计算精度的限制，接近基本极限精度，特别是在背景噪声较大的情况下，其优势更加明显.这对单分子的精确定位和跟踪、扩散方式分析、转移速率计算等具有重要的意义.【期刊名称】纳米技术与精密工程【年(卷),期】2010(008)005【总页数】7【关键词】荧光成像；单分子纳米级定位；图像信噪比；二维高斯曲面经过近30年的理论完善和技术革新，单分子跟踪(single molecule tracking, SMT)已发展成为在众多学科领域广泛应用的方法之一[1-4].SMT以单分子荧光图像为研究对象，通过合理有效的算法，一方面确定单分子的中心位置，另一方面正确地将不同帧上的同一分子以时间序列的形式连接起来，从而分析单分子的扩散方式，确定扩散系数、转移速率、步进位移等，得到丰富而详细的分子运动动力学和统计学信息.这为单分子运动特性研究、多分子共域化选择、生物分子反应过程探索等提供了强大的技术手段.单分子的定位精度是SMT研究的一个关键因素.即在多大的误差范围内确定单分子的中心位置.这不仅是单分子荧光成像系统的重要技术指标，也影响着最终对单分子运动特征的评价[5-6].较大的单分子定位误差会导致不精确的计算结果，甚至会得出与客观事实相悖的结论.对于某一特定的实验分子，荧光成像系统的技术指标、采集的荧光图像质量和单分子定位算法是影响定位精度的3大因素.成像系统的技术指标主要包括NA(numeric aperture)值、放大倍率、采集效率、CCD(charge coupled device)图像探测器像素尺寸等；荧光图像质量用信噪比(signal to noise ratio, SNR)衡量，该值由图像的单分子信号和背景噪声共同确定；单分子定位算法则以单分子在成像面的点扩散函数(point spread function, PSF)为基础，利用不同的计算方式，如质心法、相关矩阵法、绝对差求和法、二维直接高斯拟合等，实现对单分子中心的亚像素定位[7].如果说成像系统的技术指标和荧光图像质量是实现高精度的单分子定位“硬”的要求，则单分子定位算法是“软”的要求.当“硬”的系统配置固定时，“软”的算法便对定位精度起着主要的作用.本文中首先介绍了基于一定“硬”条件下，单分子定位的基本极限精度和理论计算精度，并且探讨了SNR同有效采集光子数这两个经常用于精度分析的参数之间的关系，然后提出了一种被称为图像去噪高斯掩膜算法的单分子定位算法，并依据实验用单分子成像系统具体配置，在不同的有效采集光子数(20～1 000)和背景噪声(0.1～20)条件下，对其优化的放大倍率和CCD像素尺寸及理论计算精度进行了理论分析.通过计算机仿真表明，该算法良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，在有效采集光子数(或SNR)增大时，能突破理论计算精度的限制，并接近基本极限精度，特别是在背景噪声较大的情况下，其表现更具优势.1 单分子定位的理论精度1.1 PSF与二维高斯曲面对于三维结构上远小于显微镜分辨率的单个分子，将在像空间一定区域内形成分散的电磁场斑点，其分布的情况可用点扩散函数PSF来表示，即(1)式中(2)式中J1(*)、NA、λ、r分别表示第一类一阶Bessel函数、物镜数值孔径、光波波长、像平面某点到第一零级主极大的距离.由于在实际的单分子荧光图像上，二维高斯曲面与PSF差别微小，再加之方便计算，易于处理，因而通常用其近似替代PSF[1,8]，即(3)式中σ表示拟合后二维高斯曲面的标准方差，或称宽度.当二维高斯方程与PSF 包含的体积相等时，其大小约为[9](4)下面介绍的公式推导和结果分析都是在二维高斯曲面上进行的.1.2 理论精度分析对于特定的单分子成像系统，单分子定位的精度受荧光图像质量和不同定位算法的影响，不同的算法在同一荧光图像时，其表现各不相同[7,10].通过选择恰当的算法可以达到更优的运算结果.那么这种“更优”是无限的，还是有限的？也就是说，对于特定的单分子荧光图像，存不存在这样一个精度极限，使得不管如何改进算法，单分子定位都只能得到接近于这个极限精度值，而无法获取更高精度的特征点坐标呢？Ober等[5]利用Fisher信息矩阵在仅考虑单分子荧光发射特点和相关探测系统的效率时，推导出一个不存在其他任何噪声的基本极限精度(5)N=γRt(6)式中N、γ、R、t分别表示有效采集光子数、探测系统光学效率、发射速率和曝光时间.这是在进行单分子定位时所能得到的最优精度.在实际应用中由于各种噪声及不同算法的影响，所得到的精度值都应大于这个理想值.当用二维高斯曲面近似代替单分子PSF后，其基本极限精度δfund可表示为(7)此外，Thompson等[8]在分析散粒噪声、像素化噪声和背景噪声3个方面对单分子定位精度影响的基础上，提出了一个理论计算精度δtheo的计算公式，即(8)式中s、a、b分别表示单分子PSF的标准偏差、像平面上CCD像素代表的实物尺寸和背景噪声大小.式中3项分别表示散粒噪声、像素化噪声和背景噪声对单分子定位精度的影响.不难看出，在散粒噪声为主要噪声的荧光图像中，定位精度与总采集光子的平方根成反比，而在背景噪声为主要噪声的荧光图像中，其与总采集光子数成反比.s也可以用二维高斯分布的标准方差σ代替[11]，即令s =σ，将式(4)代入式(8)，则有(9)1.3 N与SNR的关系在多个文献中提到SNR或者N与单分子定位精度的相互关系[5,7,10,12]，但都没有把N与SNR统一起来，本节即在寻求N与SNR的内在联系.众所周知，有效采集光子数N将在像平面服从PSF分布，假设其标准PSF的最大值落在某一像素点的中心位置，那么通过计算该像素范围内D0的光子数(光强)同整个PSF范围内D光子数(光强)之比NR，就可以得知该像素内的光子数(光强) (10)可将D0设置为一个中心在PSF最大值处、面积等于a2的圆形区域，则其半径r0为(11)将式(11)代入(10)，并展开二重积分后，可有(12)即(13)则荧光单分子图像的SNR为(14)当b一定时，SNR与I0(N)成正比，而当I0(N)不变时，其与背景噪声b成反比.2 单分子定位算法2.1 图像去噪高斯掩膜算法用于单分子定位的图像去噪高斯掩膜算法(image de-noising Gaussian mask，IDGM)包括荧光图像去噪[2,10]和高斯掩膜质心法[8]计算单分子中心位置两个主要部分.图像去噪的目的是尽可能地去除图像噪声(背景噪声和散粒噪声)以分离单分子图像信息.将原始CCD图像数组先转换成浮点类型Io(x,y)，经过如下卷积后即可得到去噪后图像I (x,y)，即(15)其中(16)(17)(18)(19)(20)(21)式中：Dx(x,y)、Bx(x,y)、D(x,y)、B(x,y) 分别为x方向和二维卷积后的去除散粒噪声图像和背景图像模型；Kxd、Kxb、Kyd、Kyb 为x、y方向上去除散粒噪声和背景噪声的卷积核，其中Kxd=(Kyd)T=exp(-i2/4)/B，Kxb=(Kyb)T=[fltarr(2w+1)-1/(2w+1)]，fltarr(*)表示*个元素值为0的行矩阵；w是正整数，其物理意义为大于或等于PSF第一零级半径而小于分子间距离(图像上存在多个分子时)的像素个数.高斯掩膜质心法将质心法和二维直接高斯拟合相结合，该算法运算量小、精度高、并能有效去除散粒噪声对计算结果的影响.利用高斯掩膜法计算单分子中心坐标的公式为(22)其中(23)式中：Iij、Nij分别表示图像中点(i, j)处的像素值和高斯加权值；p (xp,yp)为通过图像膨胀运算而得到的某一微粒p的像素级坐标；p (xcp,ycp)为微粒p (xp,yp)的具有亚像素分辨率的中心位置，称之为特征点坐标.2.2 中心定位精度计算假设单分子的实际中心位置为(x,y)，计算特征点坐标为，则单分子中心定位精度为(24)式中〈·〉表示对所有参与运算的坐标值的平均.该计算精度与准确度(bias)和精确度σ[7]计算稍有不同，准确度主要反映计算位置同实际中心的偏差程度，精确度反映计算位置本身的集中程度，而δp则反映了计算位置与实际中心的集中程度，更能全面地反映图像信噪比、定位算法、随机噪声等的综合影响.由于实际实验中无法得知单分子的准确位置信息，只能获取其计算位置，故本文中采用计算机仿真，对不同条件下(如I0、b、a不同等)的大数据量单分子图像序列(1 000帧)来定量分析.在每个序列中，每帧图像上除散粒噪声由泊松分布的随机值表示外，其他各参数皆保持不变.2.3 单分子仿真图像序列实验用荧光单分子成像系统以NIKON 90i荧光显微镜(Nikon，日本)为主体，配有CFI60(色差校正光学系统和无限远光学系的融合)物镜(NA0.55，放大倍率50×)、中继放大镜片组(放大倍率4×)、UV-1A荧光滤镜组(典型发射波长为420 nm)及电子增益CCD(Andor，英国)，其成像范围和像素数目分别为8 mm×8 mm和1 004×1 002.计算得知该系统的光学分辨率、单分子PSF宽度、σ、a、NR分别约为466 nm、367 nm、168 nm、40 nm和0.86%.在生成单分子仿真图像序列时，首先依据设置的有效采集光子数N和实验用单分子成像系统的实际配置来确定与PSF相近似的不同峰值I0的二维高斯曲面；然后将该二维高斯曲面叠加到具有常数背景噪声b的图像中去，并明确其中心位置；最后依据每个像素的值，用泊松分布随机值来代替各原始像素值.对于不同I0的二维高斯曲面和b，分别建立1 000帧中心位置确定而具有不同散粒噪声分布的单分子荧光图像，并依据此序列图像来计算定位精度.图1所示为当设定N=1 000、b=2.0时，单分子仿真图像序列生成的过程.此时，I0、SNR分别约为8.58和2.64.3 结果与分析3.1 实验系统的a/s和δtheoThompson等[8]指出为了得到尽可能好的精度，整个成像系统的放大倍率是个重要的因素，在大多数情况下应该调整放大倍率，使得a/s≈1时，可实现最高准确度的定位.其实，一个优化的放大倍率与总采集光子数和背景噪声的大小相关.Thompson等的结论是当N=100、b=0.7时得出来的.针对实际的单分子成像实验系统，笔者在不同的N(20～1 000)和b(0.1～20)条件下，对优化的a/s比例进行了理论计算.如图2所示，在定位精度最优的情况下，对于不同的N和b，其a/s和与之相对应的理论计算精度δtheo是不同的.当b一定时，它们的大小与N成反比；当N一定时，其与b成正比.而SNR与N和b的变化则出现相反的趋势，当b一定时，它的大小与N成正比；当N一定时，其与b成反比.除非在N或b固定的条件下，不然无论是优化的a/s，还是δtheo，都与荧光图像的SNR没有明显的单调递减的关系.在相同的SNR条件下，也可得到不同的a/s和δtheo，例如N=8 500，b=0.7(SNR= 8.50)时，a/s=0.36，δtheo =4.05 nm；N=8 650，b=2.0(SNR= 8.50)时，a/s=0.60，δtheo=4.10 nm；N=8 970，b=5.0(SNR= 8.50)时，a/s=0.96，δtheo=4.19 nm；N=9 460，b=10.0(SNR= 8.50)时，a/s=1.35，δtheo =4.33 nm 等.3.2 IDGM定位精度针对现有的单分子成像系统(σ=168 nm、a=40 nm)，参照Thompson等提出的方法，笔者对Gaussian mask(GM)、IDGM、理论计算和基本极限精度进行了比较分析.图3(a)、3(b)、3(c)、3(d)分别为当b=0.7、2.0、5.0、10.0时，N从100到10 000的变化过程中各精度值的变化曲线.该图中的计算结果与Thompson等的结果稍有不同，这主要是因为采用了不同系统配置和有效采集光子数确定方法的原因.从图中可以看出，随着N的增大，各精度值的偏差不断减小，除GM δp外，IDGM δp和δtheo接近于δfund的趋势明显，如在b=0.7情况下，当N=1 080时，IDGM δp=20.5 nm；当N=5 600时，IDGM δp =7.9 nm；当N=10 000 时，IDGM δp =4.7 nm.若在实验可能的情况下，选择高纯度、大吸收面积、高量子产量、高光学稳定性的荧光物质，并采用良好的边界锐利的滤镜组去除杂散光(如激发光二次入射、瑞利散射光等)，利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光，采用低暗噪声、高采集效率的探测器(如液氮冷却、背光照明的增强CCD或电子增益CCD)、构建高效的去噪光路(如大数值孔径物镜、共焦、双光子激发光路等)、适当增加曝光时间等，将会大大增加成像系统的有效采集光子数并降低背景噪声强度，提高单分子荧光图像信噪比，进而得到更好的单分子定位精度，实现更精确的单分子定位.图3(a)、3(b)和3(c)中，有GM δp>IDGM δp>δtheo>δfund，而在图3(d)中，当N>380时，δtheo 与IDGM δp 非常接近，甚至在某些N值，有GM δp>δtheo >IDGM δp >δfund.这不仅说明本文中提出的IDGM算法具有比GM更好的计算精度，而且由于其良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，使得它能突破Thmopson等所提出的理论计算精度的限制，特别是在背景噪声b较大的情况下，IDGM的优势更加明显.此外，在各个图的上方都标注了在相应的背景噪声b下，不同N所对应的SNR值，便于从SNR出发，去分析定位精度的变化趋势.3.3 IDGM定位实验目前已将该算法成功地应用到超高真空荧光有机分子生长设备中对绝缘体表面生长的荧光分子微粒的定位研究之中，如图4所示.实验过程中，先将整个系统排气至2×10-8 Pa的真空度，然后利用液氦对绝缘基体进行冷却使之维持一定的低温状态(可达到150 K)，然后打开分子蒸镀仪，将有机分子蒸镀到绝缘基体表面，最后通过事先已精确对齐和聚焦的荧光显微镜进行成像，并利用自主开发的单分子定位软件对观测微区中的有机分子微粒进行定位.如图5所示，荧光显微镜正确聚焦后，对生长在云母基体上的罗丹明分子微粒进行定位.待打开分子蒸镀仪后，CCD采集的荧光图像上逐渐出现若干个明亮的罗丹明分子微粒，在荧光图像上选择特定区域(图5(a)矩形框内)，则该区域内的分子微粒定位结果如图5(b)所示.在后续的研究中，将分子定位和轨迹链接结合起来，计算分子扩散系数、转移速率、步进位移等，分析分子动力学特性，这对于有机分子薄膜生长机理的探索以及有机分子与基体表面相互作用的理解具有重要的实践意义和理论意义.4 结语以单分子荧光显微术为基础的SMT，不仅揭示个体行为和大量分子平均行为的差异，而且可反映出分子微观环境的变化信息.其中单分子定位精度是SMT算法中重要的考虑因素，本文中对单分子定位算法的精度进行了详细而全面的分析，并理顺了信噪比和有效采集光子数间的相互关系.通过对IDGM算法的精度分析可以发现，它计算精度高，对图像信噪比要求低，加之以质心法为核心的计算特点，其结构简单，计算速度快.可以说，该算法在表面物理学、生物物理、细胞学等领域的单分子研究中，特别是实时在线的分子动力学研究中具有很高的应用价值.参考文献：[1] Anderson C M, Georgiou G N, Morrison I E G, et al. 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特异性核酸荧光染色反应液及其在精子DNA完整性检测中的应用[发明专利]
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专利名称：特异性核酸荧光染色反应液及其在精子DNA完整性检测中的应用
专利类型：发明专利
发明人：焦爽丽,张益,岳平,杨继高,叶鑫,洪旭涛
申请号：CN202111627546.6
申请日：20211229
公开号：CN114324274A
公开日：
20220412
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种特异性核酸荧光染色反应液，包括以下四者：精液稀释液，酸化液，荧光染料，染料稀释液。
本发明还同时提供了利用上述特异性核酸荧光染色反应液进行的检测精子DNA 碎片化的方法，包括：配制荧光染料；细胞的制备；细胞的裂解和染色；上机检测；结果判断：拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。
进一步，还可通过两种荧光细胞的个数比，从而计算该样本中的DNA损伤比例。
本发明的方法操作步骤少，特异性好，对精子DNA碎片判断准确。
申请人：重庆市人口和计划生育科学技术研究院
地址：400020 重庆市江北区红黄路18号
国籍：CN
代理机构：杭州中成专利事务所有限公司
代理人：金祺
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一种检测细胞内极性的荧光探针及其制备方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911211678.3(22)申请日 2019.12.02(71)申请人 济南大学地址 250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号(72)发明人 林伟英 郭丁一 刘闯 田明刚 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所37218代理人 安丽艳(51)Int.Cl.C09K 11/06(2006.01)C07F 9/6533(2006.01)G01N 21/64(2006.01)(54)发明名称一种检测细胞内极性的荧光探针及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针：。
该探针可用于检测细胞内极性。
本发明制备了极性敏感型PTT增敏剂，用于研究光致细胞死亡过程中细胞内极性的变化。
该探针以活细胞中的线粒体为靶点。
激光照射一段时间后，经探针预孵育的Hepg2活细胞的细胞活力显著下降。
探针成功揭示了光诱导细胞死亡过程中线粒体极性的下调。
权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 110724524 A 2020.01.24C N 110724524A1.一种靶向线粒体检测细胞内极性的荧光探针，其化学结构式为：。
2.一种如权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）化合物a与化合物b在氮气保护下于DMF中加热反应，分离提纯到化合物c：；（2）在氮气保护下，化合物c与化合物d在碳酸钾和DMF溶液中反应，分离提纯得化合物e：；（3）化合物e与化合物f在氮气保护下于乙腈中加热反应，分离、提纯得化合物g，即为荧光探针：。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述化合物a与化合物b的物质的量比为1:1；步骤（2）中，所述化合物c与化合物d的物质的量比为1:5；步骤（3）中，所述化合物e与化合物f的物质的量比为1:1。
高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710847777.5(22)申请日 2017.09.19(71)申请人 甘肃省商业科技研究所有限公司地址 730010 甘肃省兰州市城关区雁南路18号(72)发明人 周鑫魁 洪霞 钱滢文 高志莹 王杰斌 何海宁 (74)专利代理机构 甘肃省知识产权事务中心62100代理人 张克勤(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)G01N 30/02(2006.01)(54)发明名称高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法(57)摘要本发明公开了一种高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法，属于食品安全检测领域。
该高荧光强度的荧光探针的合成方法，以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。
该荧光探针荧光强度高，合成简便，针对含有氨基化合物反应特异性强。
所生成的荧光探针与β-受体激动剂衍生速度快，荧光强度高。
增加该类药物检测灵敏度，降低了检测成本。
权利要求书2页 说明书7页 附图1页CN 107505301 A 2017.12.22C N 107505301A1.一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。
2.根据权利要求1所述的高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：具体步骤为，A、按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8-1.2份，均匀搅拌30min，得到混合溶液；B、用14.8-15.2份pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并盐酸溶液;C、用8-12%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀,过滤，用冷水多次洗涤滤饼;D、用45-55%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑;E、取6.8-7.2份氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入步骤D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。
一种通用引物单荧光分子检测技术及试剂盒[发明专利]
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专利名称：一种通用引物单荧光分子检测技术及试剂盒专利类型：发明专利
发明人：许文涛,罗云波,牛晨启,黄昆仑,徐媛聪,杜再慧,贺晓云
申请号：CN201810206239.2
申请日：20180313
公开号：CN108410956A
公开日：
20180817
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种多重数字PCR检测方法及引物、探针和试剂盒。
本发明将通用引物与多重数字PCR进行结合应用，开发出了一种新的核酸检测方法，至少实现了微量、灵敏、精准度高的高通量多重核酸的检测特别是转基因的检测。
此外，本发明通过对通用引物种类、浓度以及各修饰特异引物浓度等因素进行优化，建立了一套通量高、特异性强的多重转基因成分筛查检测体系或试剂盒。
通过对该体系特异性的验证，确保该检测体系可以满足我国进口口岸的各类转基因成分检测的需要。
申请人：中国农业大学
地址：100083 北京市海淀区清华东路17号中国农业大学(东区)
国籍：CN
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一种用于特异性检测肼的近红外荧光化合物及制备方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010711228.7(22)申请日 2020.07.22(71)申请人 安徽农业大学地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西路130号(72)发明人 王毅 朱美庆 赵宗元 凡福港 吴祥为 花日茂 (74)专利代理机构 合肥金安专利事务所(普通合伙企业) 34114代理人 金惠贞(51)Int.Cl.C07C 255/43(2006.01)C07C 253/30(2006.01)C09K 11/06(2006.01)G01N 21/64(2006.01)(54)发明名称一种用于特异性检测肼的近红外荧光化合物及制备方法(57)摘要本发明公开一种新型特异性识别肼的近红外荧光化合物，(E)‑2‑(2‑(3‑(二氰基亚甲基)‑5,5‑二甲基环己‑1‑烯‑1‑基)乙烯基)‑5‑(二乙氨基)苯基4‑溴丁酸，其可以特异性检测生物体内的肼；该近红外荧光化合物制备过程简单，原料易得，成本低廉，结构稳定，并且具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性，可进入活细胞和动物组织中并与外源肼发生反应，产生可肉眼分辨的强烈红色荧光；通过紫外吸收和荧光分光光度法分析得出该近红外荧光化合物可以在各种干扰物下对肼有着优越的选择性，对常见生物分子有着很强的抗干扰能力；不仅可对外源性肼选择性识别，而且能在各种活细胞的生长环境下高灵敏度的定量检测肼，并成功应用于活细胞及斑马鱼成像中。
权利要求书3页 说明书11页 附图4页CN 111807993 A 2020.10.23C N 111807993A1.一种特异性检测肼的近红外荧光化合物，其特征在于：所述近红外荧光化合物为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸，其分子式为C27H32BrN3O2，化学结构式如式(I)所示：2.权利要求1所述一种特异性检测肼的近红外荧光化合物的制备方法，其特征在于操作步骤如下：(1)在氮气保护下，将1.0g(E)-2-(3-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈(DHDM)、1.0mL三乙胺和50mL无水二氯甲烷混合，冰浴降温至0℃；(2)缓慢滴入0.62mg 4-溴丁酰氯，室温下搅拌反应10-12小时，得到混合物；(3)将混合物倒入冰水中搅拌，并用二氯甲烷萃取3次，每次萃取用10mL二氯甲烷；(4)用无水硫酸钠干燥，将有机相浓缩，得到粗产物；用正已烷和乙酸乙酯按体积比3:1配制成洗脱液通过柱色谱法洗脱纯化粗产物，得到1.03g紫黑色产物(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸DCDB，产率为72％。
【CN110128566A】一种识别甲醛的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910363791.7(22)申请日 2019.04.30(71)申请人 盐城工学院地址 224000 江苏省盐城市亭湖区希望大道中路1号(72)发明人 张怀红 周桃 于琴 杨正莹 仓辉 蔡照胜 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200代理人 楼高潮(51)Int.Cl.C08B 37/08(2006.01)C09K 11/06(2006.01)G01N 21/64(2006.01)G01N 21/359(2014.01)(54)发明名称一种识别甲醛的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种识别甲醛的近红外荧光聚合物探针及其制备方法和应用，具体公开了式Ⅰ结构的近红外荧光聚合物探针。
本发明提供的聚合物探针是由近红外荧光分子与生物相容性壳聚糖经过化学反应而成，其中，所述近红外荧光分子作为近红外荧光响应单元，能够与甲醛发生化学反应发出红光，实现对甲醛的特异性响应；壳聚糖作为聚合物的主链构成单元，赋予聚合物探针良好的水溶性和生物相容性。
本发明提供的近红外荧光聚合物探针可用于水溶液中、活细胞内及活体内的甲醛检测及成像，在环境监测、生物成像与传感方面具有重要的应用前景。
式Ⅰ。
权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 110128566 A 2019.08.16C N 110128566A1.一种识别甲醛的近红外荧光聚合物探针，其特征在于，所述聚合物探针具有式Ⅰ的通式结构：其中n＝30～120。
2.权利要求1所述的识别甲醛的近红外荧光聚合物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将壳聚糖和近红外荧光分子混合，在组合催化剂作用下进行酰化反应，得到含近红外荧光壳聚糖的聚合物探针。
3.权利要求1所述的识别甲醛的近红外荧光聚合物探针的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光分子具有式Ⅱ结构：4.根据权利要求2所述的识别甲醛的近红外荧光聚合物探针的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖和近红外荧光分子Ⅱ的质量份数为：壳聚糖1～3份，近红外荧光分子Ⅱ5～10份。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910299030.X
(22)申请日 2019.04.15
(71)申请人 北京化工大学
地址 100029 北京市朝阳区北三环东路15
号
(72)发明人 苏昕 蔡爽 喻长远 李丽丹
邓莹楠
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 王春霞
(51)Int.Cl.
G01N 21/64(2006.01)
G01N 1/28(2006.01)
(54)发明名称
一种高度特异性的单分子荧光检测方法
(57)摘要
本发明公开了一种高度特异性的单分子荧
光检测方法。
所述单分子检测方法包括如下步
骤：(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，
形成复合物；(2)将捕获探针固定于玻片上，并加
入复合物，捕获探针与一条识别探针结合；(3)向
玻片上加入带荧光标记的信号探针，信号探针与
两条识别探针动态结合；(4)将玻片置于显微镜
载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单
分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度-时
间轨迹呈现ON -OFF交替变化且荧光的t on 和t off
相对较短的单分子点即为目标物。
本发明能够在
单分子水平直接指认目标物分子，高度可信的区
分目标物与非目标物，可以大幅度提高单分子荧
光检测的灵敏度、
特异性和重复性。
权利要求书2页 说明书5页 附图1页CN 110208226 A 2019.09.06
C N 110208226
A
权 利 要 求 书1/2页CN 110208226 A
1.一种单分子荧光检测探针系统，包括带荧光标记的信号探针和能与待检测的目标物结合的两条识别探针；
当两条所述识别探针均与待检测的目标物结合时，会诱导两条所述识别探针与所述信号探针之间的结合稳定度的变化，即荧光强度-时间轨迹呈现ON-OFF交替变化。
2.根据权利要求1所述的探针系统，其特征在于：一条所述识别探针由捕获探针结合域、目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
另一条所述识别探针由目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；
一条所述识别探针通过所述捕获探针结合域与捕获探针形成稳定结合；
两条所述识别探针均通过所述目标物结合域与目标物形成稳定结合；
两条所述识别探针均通过所述信号探针接收臂与所述信号探针形成动态结合。
3.根据权利要求1或2所述的探针系统，其特征在于：所述信号探针与所述信号探针接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述信号探针接收臂相互作用区段的GC含量≤50％；
将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；
所述荧光基团为Cy3荧光基团。
4.一种单分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物；
(2)将捕获探针固定于玻片上，并加入所述复合物，所述捕获探针与一条所述识别探针结合；
(3)向所述玻片上加入带荧光标记的信号探针，所述信号探针与两条所述识别探针动态结合；
(4)将所述玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度-时间轨迹呈现若干次ON-OFF交替变化且荧光的t on和t off 相对较短的单分子点即为目标物；
所述ON-OFF交替变化指的是所述信号探针结合时表现的荧光ON状态与其解离时表现的荧光OFF状态的交替变化；
所述t on指的是荧光ON状态持续的时间，所述t off指的是荧光OFF状态持续的时间。
5.根据权利要求4所述的单分子检测方法，其特征在于：所述信号探针与每条所述识别探针的接收臂互补的碱基个数为5～7个；
所述信号探针与所述识别探针的接收臂相互作用区段的GC含量≤50％。
6.根据权利要求4或5所述的单分子检测方法，其特征在于：将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；
所述荧光基团为Cy3荧光基团；
所述捕获探针与所述识别探针之间互补的碱基个数至少为20个。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的单分子检测方法，其特征在于：步骤(1)中，形成所述复合物的条件如下：
温度为20～27℃，时间为30～60分钟；
8.根据权利要求4-7中任一项所述的单分子检测方法，其特征在于：步骤(4)中，在监测时间500s内荧光状态变化次数大于3次的单分子点为所述目标物；
2。