酶的高通量筛选word版本
酶的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
随机插入/去除技术 半理性外显子重组技术 合成重组技术 计算机辅助设计技术
酶分子的定向进化（小结）
定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和 研究酶蛋白构效关系的良好工具。 随着各种基因技术的应用和发展，究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突 变体库的技术。 突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续 发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术， 还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技 术和蛋白展示库技术。尤其是一些无明显表型的突变体的 筛选还需给与更多的研究与重视 。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的置换而F, Tiss A, Rivière C, Verger R: Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Technol 2000, 133-153. A comprehensive and detailed review about all lipase assays involving carboxylic ester hydrolysis 11Beisson F, Ferté N, Nari J, Noat G, Arondel V, Verger R: Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J Lipids Res 1999, 40:2313-2321. 12Klein G, Reymond J-L: Enantioselective fluorogenic assay of acetate hydrolysis for detecting lipase catalytic antibodies. Helv Chim Acta 1999, 82:400-407. 13Pérez Carlón R, Jourdain N, Reymond J-L: Fluorogenic polypropionate fragments for detecting stereoselective aldolases. Chem Eur J 2000, 6:41544162. 14List B, Barbas CF III, Lerner RA: Aldol sensors for the rapid generation of tunable fluorescence by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:15351-15355. 15Copeland GT, Miller SJ: A chemosensor-based approach to catalyst discovery in solution and on solid support. J Am Chem Soc 1999, 121:43064307. 16. Morís-Varas F, Shah A, Aikens J, Nadkarni NP, Rozzell JD, Demirjian DC: Visualization of enzyme-catalyzed reactions using pH indicators: rapid screening of hydrolase libraries and estimation of the enantioselectivity. Bioorg Med Chem 1999,7:2183-2188. 17. Janes LE, Löwendahl AC, Kazlauskas RJ: Quantitative screening of hydrolase libraries using pH indicators: identifying active and enantioselective hydrolases. Chem Eur J 1998, 4:2325-2331. 18 Bornscheuer UT: Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases. Curr Opin Biotechnol 2002,13:543-547. 19Jenne A, Gmelin W, Raffler N, Famulok M: Real-time characterization of ribozymes by fluorescence resonance energy transfer (FRET). Angew Chem Int Ed Engl 1999, 38:1300-1303. 20Jandeleit B, Schaefer DJ, Powers TS, Turner HW, Weinberg WH (1999) Combinatorial materials science and catalysis. Angew Chem Int Ed 38:2494–2532 21Reetz MT, Becker MH, Liebl M, Fürstner A (2000a) IR-thermographic screening of thermoneutral or endothermic transformations: the ring-closing olefin metathesis reaction. Angew Chem Int Ed 39:1236–1239 22Holzwarth A, Schmidt H-W, Maier WF (1998) Detection of catalytic activity in combinatorial libraries of heterogeneous catalysts by IR thermography. Angew Chem Int Ed 37:2644–2647 23Hirose A, Esaka Y, Ohta M, Haraguchi H: On-line HPLC determination of enzymatic activity of alkaline phosphatase in natural water using spectrofluorometric detection. Chem Lett 1993:307-310.
酶的高通量筛选与定向筛选
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突
变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的臵换而引起的预期 性状的较小提高。
酶分子的定向进化
半理性库semi-rational或简洁库‘smart’ libraries的技术
构建突变体库的方法包括以易错PCR和同源基因重
组（DNA shuffling）为代表的各种基因突变和基 因重组技术。 突变体库的多样性与冗余性，基于对酶的构效关系 的研究发展了一些构建半理性库或简洁库的技术。
检测培养基筛选法 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以 辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此 区别不同类型或生理特性不同的微生物。这种筛选可以在检测平板中 进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高 通量筛选。
酶的高通量筛选
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个
别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
微生物酶筛选的一般流程
微生物酶筛选的一般流程英文回答：Microbial enzyme screening typically involves several steps to identify and select enzymes with desired properties. Here is a general process that is commonly followed:1. Identification of target enzymes: The first step is to determine the specific enzyme activity that is of interest. This could be based on the desired function or the ability to catalyze a specific reaction.For example, let's say we are interested in finding enzymes that can degrade cellulose for biofuel production.2. Source selection: Once the target enzyme is identified, the next step is to select a suitable microbial source that is likely to produce the desired enzyme. Microbes such as bacteria, fungi, and yeast are commonlyused sources.Continuing with our example, we could choose to screen cellulose-degrading enzymes from a variety of fungi known for their ability to break down plant material.3. Isolation and cultivation: The selected microbial source is isolated and cultivated under controlled conditions to optimize enzyme production. This may involve growing the microbe on specific media or in specialized bioreactors.In our case, we would isolate the chosen fungi and cultivate them in a nutrient-rich medium that promotes cellulase production.4. Enzyme extraction: Once sufficient enzyme production is achieved, the next step is to extract the enzymes from the microbial culture. This can be done through various methods such as centrifugation, filtration, or precipitation.For example, we could use centrifugation to separatethe fungal cells from the culture broth, and then collectthe supernatant containing the secreted enzymes.5. Enzyme screening: The extracted enzymes are then screened for the desired activity. This can be done through various assays and tests that measure the enzyme's abilityto catalyze the desired reaction.In our case, we could perform assays to measure the ability of the extracted enzymes to break down celluloseinto glucose.6. Enzyme characterization: Enzymes that show promising activity are further characterized to determine their properties. This may include studying their optimal pH and temperature range, stability, substrate specificity, and kinetic parameters.For example, we could determine the optimum temperature and pH at which the cellulase enzyme functions best, aswell as its ability to degrade different types of cellulose.7. Optimization and engineering: If needed, the selected enzyme can be further optimized or engineered to improve its properties. This can be done through techniques such as protein engineering or directed evolution.In our case, we could use protein engineering to modify the cellulase enzyme to make it more efficient in breaking down cellulose.8. Scale-up and production: Once the desired enzyme is identified and optimized, it can be scaled up for large-scale production. This may involve transferring the enzyme-producing strain to industrial fermentation systems and optimizing the production process.For example, we could transfer the selected fungal strain to a large-scale bioreactor and optimize the fermentation conditions for maximum cellulase production.Overall, the process of microbial enzyme screening involves identifying the target enzyme, selecting asuitable microbial source, isolating and cultivating the microbe, extracting and screening the enzymes,characterizing and optimizing the selected enzyme, andfinally scaling up production.中文回答：微生物酶筛选通常包括几个步骤，以确定和选择具有所需特性的酶。
建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法_孙艳
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2011年第30卷第3期·612·化工进展建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法孙艳，杨海麟，王武（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122）摘 要：建立了一种以滤膜为基础的高通量筛选耐高温胆固醇氧化酶产生菌的方法。
利用酶偶联及胆固醇不溶于水的特性产生显色透明圈。
酶的热处理过程和酶与底物的反应过程分开，有效地防止酶在热处理前与底物反应。
高温处理是在滤膜上进行，从而克服了高温琼脂平板变软或熔化的缺点。
用该方法筛选时，产生的红褐色透明圈较明显，易于挑出性能改善的突变菌株。
转印所用NC膜的价格便宜，操作比较简便。
关键词：胆固醇氧化酶；高通量筛选；定向进化中图分类号：Q 185 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2011）03–0612–04High-throughput screening methods for selecting cholesterol oxidase with improvedthermal stabilitySUN Yan，YANG Hailin，WANG Wu（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）Abstract：A high-throughput screening method based on membrane for selecting cholesterol oxidase mutants with improved thermal activity was proposed. This method takes advantage of the fact that the process of enzyme treatment and the reaction between enzyme and substrate was separated effectively，thus preventing the enzyme from reaction with substrate before heat treatment. High temperature treatment only involved the membrane not the agar plate，thereby the problem of softening or melting of the agar plate was resolved. This method is applicable to the screening of mutant colonies with high activity which produce obvious reddish brown transparent circle on the agar plate. The nitrocellulose filter membrane used for transfer printing is cheap and the major advantages of this method are reliability and simple，rapid screening.Key words：cholesterol oxidase；high-throughput screening；directed-evolution胆固醇氧化酶（COD，EC1.1.3.6）是一类黄素蛋白酶，能特异性催化氧化异构化含3β羟基的类固醇，使其类固醇环上的Δ5-6双键转移到Δ4-5位置[1]。
第十章 新酶的发现与筛选课件
淀粉酶：淀粉（底物）+ 碘液（指示剂） 氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂） 溴甲酚紫，pH >6.2显紫色；pH <4.8显黄色
2020/3/20
（2）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。
（3）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
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二、 微生物新酶的获取途径
获取途径
购买商品化的酶 购买产酶微生物 从自然界筛选产酶微生物 从基因克隆库中筛选酶基因
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富集培养方法
（4）稀释培养法
长期生长在营养贫乏的环境中的微生物对过高 浓度的有机质敏感，生长受到抑制，可用稀释后 的培养基进行富集培养。
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四、 从自然界筛选产酶微生物
3、菌株分离纯化
富集培养获得具有生长优势的菌株，但其他菌 株依然存在，需要用合适的方法加以分离
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富集培养方法
（3）抑制不需要的菌类
通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非
目的微生物的数量
高温处理（80℃）筛选芽孢菌 抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、
孟加拉红等
抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等 抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等
国内外主要菌种保藏机构：ATCC、DSMZ 、 CCTCC、CICC、CGMCC
特点： 方便易得，成本较低（600-800元/株） 需要进一步筛选
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第十章 新酶的发现与筛选
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微生物作为酶源的优点
（ 2 ）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 （ 3 ）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
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第10章 新酶的发现与筛选
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二、 微生物新酶的获取途径
购买商品化的酶
购买产酶微生物
获取途径 从自然界筛选产酶微生物
第10章 新酶的发现与筛选
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示例1 基因组序列搜索
查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase
2018/8/5
第10章 新酶的发现与筛选
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2、 基因挖掘法
基因组狩猎原理
以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比 对，获得中等相似度（ 50%~70% ）的酶进行克 隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。
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第10章 新酶的发现与筛选
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示例2 数据库比对寻找相似酶序列
酶探针的氨基酸序列
NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus]
GenBank: BAP73216.1
1 61 121 181 241 301 MTNQKFFTLS AETYKTYPEL IHSPFFDKDL FSPFLQNQTP QVLLLWVYKR YTKYNSEAQK NGNKIPAVAV GAALKETKKP NIDLETAWKQ GIVEFSQKND GILPVTTSAK VGTGTKWYKA REEIFITDKF LEELYKSGKA ILLEAYSPLG IERIKQAQDI EETDATFSQE SSLHKISEDP KNIGVSNFTV PLQKKPADAD FSFDLTEEEV LTDIVKLSLD KSALETALKK EDLKKVLAIA QQPFYQYLKE KKITDLGLQH TVPGIVHIDA LGVDYVDLYL EIKPQVNQIE LSEKYNKTEA EPVRLYWVDF
酶的高通量筛选与定向筛选
无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个
别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
基于比色
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反
应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体
生物催化研究过程
酶的筛选
酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基筛选法 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生 长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。
– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势 而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑 制，从而得到所需的目的菌株。 – 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌 株。
得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛 选的主要研究和发展方向。 随着生物催化在精细化工和医药行业的广 泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手 性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产 品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器 设备的高成本的检测方法成为可能并将逐 渐得到更多的应用。
酶定向进化文库的筛选方法
酶定向进化文库的筛选方法徐匆;李艳芳;黄皓;梁卫驱;胡珊;陈仕丽;罗鸿斌;罗华建【摘要】酶工程作为生物技术的主体之一,对农产品加工等的发展具有广泛作用.自然界中的酶往往不能满足实际生产,因此需要通过模拟自然界中的蛋白质进化,对酶进行改造和突变文库筛选,最终得到符合实际生产的酶.目前,改造酶的途径主要有定点突变和定向突变两种.突变体文库的建立方法较为成熟,并且建立起的文库库容也能够达到研究者的要求,但是突变体文库的筛选受现有技术等所局限,成为了定向进化技术的瓶颈.介绍了几种常用的突变体文库的筛选方法,对它们的原理及特点进行阐述,并对未来的发展方向及趋势进行了总结.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)005【总页数】5页(P194-197,207)【关键词】酶定向进化;筛选方法;FASC【作者】徐匆;李艳芳;黄皓;梁卫驱;胡珊;陈仕丽;罗鸿斌;罗华建【作者单位】东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞理工学院,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086【正文语种】中文【中图分类】Q814生物技术是当今发展最迅速、应用领域最广泛的高新技术。
农业生物技术正在成为农业竞争的焦点和核心，酶工程作为生物技术中重要的组成部分，是现代酶学理论与化学技术的交叉学科[1]，酶制剂在农产品加工，如淀粉、甜味剂、乳品、果蔬贮藏、饲料加工等方面都有广泛应用。
随着生物技术和酶动力学的研究进步，酶学进入了一个快速发展的阶段。
1个多世纪以来，酶的特殊催化功能和效果使其在很多领域都代替了非生物催化剂。
目前全世界都在倡导可持续发展、可再生资源利用，使用清洁生产技术已经成为不可回避的应用技术现状，而使用酶制剂是其中非常重要的一部分。
新脱氨酶的筛选 cas9
新脱氨酶的筛选涉及到基因编辑技术中的CRISPR-Cas9系统。
筛选通常需要以下几个步骤：
1. 设计合成sgRNA文库：这一步骤是筛选过程的基础，通过计算机设计待筛选的sgRNA文库并富集阳性克隆，以用于后续的基因编辑实验。
2. 构建慢病毒载体：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。
3. 感染宿主细胞：将构建好的慢病毒载体感染宿主细胞，使基因编辑序列进入细胞，对细胞内的基因进行编辑。
4. 高通量测序：通过高通量测序等方法，对经过基因编辑的细胞进行大规模筛查，找出具有特定基因型或表型的细胞，从而筛选出具有特定功能的基因。
5. 数据分析：对高通量测序得到的数据进行分析，找出具有特定功能的基因或基因组合，进一步研究其在生物学、医学等领域的应用价值。
总之，新脱氨酶的筛选是一个需要多步骤、多技术手段的过程，需要综合运用基因编辑技术、高通量测序技术、生物信息学等多种技术手段。
细胞筛选一嘌呤霉素Word版
细胞筛选一嘌呤霉素(一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105 个/ml 的细胞悬液。
3. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
） 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6. 在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二) 转染细胞 1. 第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2. 第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
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报告人：黄剑宇 导 师: 张 卫
生物催化简介
生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转 化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。
▪ 优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶 具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比 拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。
– 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌 株。
▪ 检测培养基筛选法 ▪ 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以
辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此 区别不同类型或生理特性不同的微生物。这种筛选可以在检测平板中 进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高 通量筛选。
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
pH指示剂显色高通量筛选
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反 应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选
Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体
Quick E 示意图
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
荧光共振能量转移底物的高通量筛选
荧光共振能量传递底物，不仅有非常好 的静态定位能力，也能提供分子内或分子 间两个荧光基团在距离和方向上的动态变 化。
将这种方法扩展，可用于研究生物多聚 体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切 反应，以及DNA发夹结构的去折叠等。这 种技术最近被用来检测核糖核酸酶反应活 性。
▪红外检测技术是一种新颖的 有发展前途的高通量筛选技术， 它不需要生色基团或荧光基团 的加入，避免了比色和荧光检 测方法的局限性，但是这种技 术目前还无法进行定量，只能 检测催化活性较高的酶，对酶 活的进一步研究还需借助传统 方法，方法本身还需要进一步 的发展和完善。
借助复杂的仪器设备的高通量筛选
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
显色或荧光底物的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。
基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。
但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
酶的筛选（小结）
比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法 得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛 选的主要研究和发展方向。
随着生物催化在精细化工和医药行业的广 泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手 性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产 品价值的提高也将使得很多借助复杂仪器 设备的高成本的检测方法成为可能并将逐 渐得到更多的应用。
▪ 缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全 丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的 底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以 商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。
▪ 实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经 济优势才能得到生产应用
高效液相色谱, 质谱和毛细管电泳也被用来 检测反应速度，但是作为一种高通量筛选 技术，这些方法测试成本较高，而且每天 每台仪器最高只能检测几百个样品，方法 的使用受到一定的限制。
采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛 选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏 而且准确，但由于放射性其使用会受到限 制无法推广使用。
采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。
这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要：
生物催化研究过程
酶的筛选
▪ 酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 ▪ 选择培养基筛选法 ▪ 通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生
长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。
– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势 而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑 制，从而得到所需的目的菌株。
酶分子的定向进化
通过以上方法从自然界筛选到的酶通常还 无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括
酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受
力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个 别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。
基于反应热力学变化红外检测的高通量筛选
▪ 所有的物质都可以发射红外线，光电平面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应过 程中的热量变化（检测波长范围3-5μm ，温度变化10-100mK）。放热反应在红外 成像中表现为“热”点，相反吸热反应表现“冷”点，通过对“热”点或“冷”点的 分辨，可以检测反应的进行与否。
酶的高通量筛选
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
基于检测培养基筛选法的，生色基团 或荧光基团的底物参加的催化反应是最容 易实现高通量筛选的。
通过监测反应过程中的颜色和荧光的变化可 以有效地监测反应的进行。
使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物， pH指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以 实现高通量实时检测。