好氧反硝化细菌培养基配制
好氧反硝化细菌的筛选及培养条件的初步研究
３ １０ ； ． 江 师范 大 学 行 知 学 院 ， 江金 华 ２０ ４ ３ 浙 浙
摘 要： 通过涂布平板 分离 法从 养殖水体 污泥 中共 分离 到 １ ２株好氧反硝化细菌 ， 通过反硝化 能力 的测定 ， 中筛选 出 从 １ 株具有较强反硝化作用 能力 的菌株 （ ２ ， 以此 为研究对象 ， 行最适培养基 、 Ｄ ）并 进 生长温度及菌体浓度 的测定。结果表明菌 株Ｄ ２的最适培养基为硝酸盐培养基 ， 最适生长温度为 ３ ｃ ７。左右 ， 在最适培养条件下最高生长浓度为 ４２ ｌＳ Ｌ ．ｘ Ｏ／ 。 ｍ
．
ｇ ｏ ｔ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ｆ ｒ ａ ｒ ｂ ｃ ｄ ｎ ｔ ｆ ｉｇ ｂ ｃｅ ｉ ．Ｄ２’ ｘ ｍｕ ｃ ｎ ｅ ｔａｉ ｎ ｕ ｄ ｒ ｏ ｔ ｌ ｇ ｏ ｔ ｒ ｗ ｈ ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ｏ ｅ ｏ ｉ ｅ ｉ ｉ ｎ ａ ｔ ｒ Ｄ２ ｒｙ ａ ｓ ｍａ ｉ ｍ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｅ ｐ ｉ ｒ ｗ ｈ ｏ ｍａ
ｔ ｅ ｔａ ｎ ｈ ｓｒ ｉ Ｄ２’ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗ ｔａ ｉ ａｅ ｉ ｈ ｓ ｓ ｉ ｂｅ ｍｅ ｉｍ．ａ ｄ ３ ℃ ｉ ｈ ｓ ｓ ｉ ｂ ｅ Ｓ ｈ ｅｕｔ ｓ ｏ ｈ ｔｎｔ ｔ ｓ ｔｅ ｍｏ ｔ ｕ ｔ ｌ ｄｕ ｓ ｒ ａ ｎ ７ ｓ ｔｅ ｍｏ ｔ ｕｔ ｌ ａ
ｂ ｄ ｓ ｇ ｔｅ ｓｒａ ｌｔ ｍｅ ｏ ．Ｏ ｅ ｏｙ ｕｉ ｈ ｐｅ ｄ ｐａｅ ｔ ｄ ｆｔ ｍ，ｏ ｅ ｓ ａ （ ２ ｉ ｔ ｎ ｅｔｄ ｎｔｆ ａ ｏ ａ ａｉ ａ ｎ ｈ ｈ ｎ ｔ ｉ Ｄ ）ｗ ｔ ｓ ｏｇ ｓ ｅ ｉ ｉｅｔ ｎ ｃｐ ｃ ｙ ｗ ｓ ｒｎ ｈ ｒ ｒ ｉ ｉ ｔ
第２ ７卷 第 ４期
好氧反硝化细菌培养基配制
好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5.富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 minLB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 minDM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌20 min采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
好氧反硝化菌种DF2的分离鉴定及生理生化特性分析
进 出水 ｐ Ｈ
１５ 反硝 化菌 的脱 氮性 能考 察 ．
不 同的反硝化细菌分别具有不 同的反硝化性 能。根据前期获得的 ｌ Ｏ株反硝化细菌和筛选 ，对 获 得 的最 优 菌株进 行 了特性 考察 。碳 源 、溶 解氧 、 Ｐ（ （ 和 ｐ ｃ） Ｎ） Ｈ值是影响硝化与反硝化进程的 主要 因素，因此设计 了不 同的试验环节 ， 来确定最 佳反硝化条件。
表 １ 测定 项 目及方 法
Ｔ ｂ ｅ １ Ｄｅ ｅｍｉ ａ ｉｎ ｏ ｔ ｅｐ ｒ ｍｅｅ ｓａ ｔ ｏ ｓ ａ ｌ ｔ ｒ ｎ ｔ ｆ ｈ ａａ ｔｒ ｎｄｍｅｈ ｄ ｏ
１ 、５ 、１ 、１ 等 ６个不 同梯 度 ，在 ３ ℃的 、３ 、７ ０ ５ ０ １０ｍＬ的反 硝化 培养基 中培养培 养 ５ｄ ０ ，通过 定 时 测定 Ｏ ｏ变化 ，检测 脱氮 效果 ，分析 ＣＮ对 脱氮 Ｄ６ ｏ ／ 能力影 响 。
Ｄｏ 、Ｔ
测 定方法
过硫 酸 钾氧化 ． 紫外分 光光 度法
纳 氏试 剂分 光光度 法
紫外 分Байду номын сангаас 光度 法
Ｎ（ １萘 基）乙二胺 盐 酸盐光 度法 溶解 氧 仪
便携 式 ｐ Ｈ计
培养 ５ ， 通过定时测定 Ｏ ６ 变化 ， ｄ Ｄ０ ０ 可以反应菌株 适 宜 的生长 温度 。 １ ． 溶解 氧对反 硝化 细 菌生 长及 脱 氮能 力影 响 ．５ ５ 通 过设 置静 止厌 氧密封 、 静止 封 口、 ｍ ｎ １０ ・ｉ ２ｒ 震荡及 １０ ・ ｎ 震荡 ４ ６ ｍｉ ｒ 种不 同的溶解氧条件 ，在 ３ ０℃ 的 １０ ０ ｍＬ的反硝 化培 养基 中培养 培养 ５ ， 检 ｄ 测脱氮效果 ，分析溶解氧对脱氮能力的影响。 １ ． ｐ 对反硝 化 细 菌生长及 脱 氮能 力影响 ．６ Ｈ ５ 设 置 ｐ 为 ５ 、６０ ．、７０ ．、８０ ． Ｈ ． ０ ．、６５ ．、７５ ．、９０ 等６ 个梯度 ， ３ 在 ０℃的 １０ Ｌ的反硝化培养基 中 ０ ｍ 培养培养 ５ ， 通过定时测定 Ｏ ６ 变化 ， ｄ Ｄ０ ０ 检测脱氮 效果 ，分析 ｐ Ｈ对脱氮能力影响。 １６ 周 质 Ｎ ． ＡＲ亚基基 因 （ ａ Ａ ） ｎ ｐ 的扩增
反硝化菌培养流程
反硝化菌培养流程
反硝化细菌的培养需要遵循以下步骤：
1. 富集培养：首先，需要准备适合反硝化细菌生长的培养基。
常用的培养基成分包括KNO3、柠檬酸钠、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O和陈海水（或蒸馏水）。
将这些成分溶解于水后，调整pH至，然后分装于试管或烧瓶中。
在121℃的蒸汽下灭菌20分钟以杀死有害微生物。
接着，在富集培养液的试管中分别加入少量的海泥、池泥或河泥。
在20℃或25-30℃下培养5-15天或3-10天。
如果培养液变混浊，有气泡产生，或者检验到有氨和亚硝酸产生，则说明有反硝化细菌生长。
2. 分离培养：在富集培养的基础上，可以通过适当的分离培养基进行反硝化细菌的分离。
分离培养基的成分包括葡萄糖、酒石酸钾钠、KNO3、
K2HPO4、CaCl·2H2O和陈海水（或蒸馏水）。
将这些盐类溶于水中，调整pH至，然后装入烧瓶中。
在121℃的蒸汽下灭菌20分钟。
将经过富集培养的反硝化细菌接种到分离培养基中，继续在20℃或25-30℃下培养。
通过观察和检测，可以挑选出具有优良反硝化性能的菌株。
请注意，上述步骤仅为反硝化细菌培养的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
同时，工作人员应确保实验操作的安全性，穿戴适当的防护装备，并遵循相关的实验室安全规定。
好氧反硝化细菌培养基配制知识分享
好氧反硝化细菌培养基配制好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5. 富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 minLB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 minDM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌20 min采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法一、引言污水处理是一项重要的环保工作，有效的污水处理可以减少对环境的污染，保护水资源。
在污水处理过程中，菌种的选择和培养是关键步骤之一。
本文将介绍一种常用的污水处理培养菌种方法，以提供参考和指导。
二、菌种选择在污水处理过程中，常用的菌种有好氧菌、厌氧菌和硝化菌等。
好氧菌主要用于有机物的降解，厌氧菌主要用于有机物的发酵和产气，硝化菌主要用于氨氮的氧化。
根据实际情况和处理要求，选择适当的菌种进行培养。
三、培养基配制1. 好氧菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：10g- 氯化铵：1g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.0左右2. 厌氧菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：10g- 氯化钠：5g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.2左右3. 硝化菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：5g- 硝酸铵：1g- 硝酸钠：1g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.5左右四、菌种培养1. 好氧菌培养：a. 取一定量的好氧菌接种于含有好氧菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为30℃），静置培养一段时间（一般为24小时）；c. 观察培养基是否出现浑浊现象，测定菌液的浓度。
2. 厌氧菌培养：a. 取一定量的厌氧菌接种于含有厌氧菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为37℃），静置培养一段时间（一般为48小时）；c. 观察培养基是否出现气泡和沉淀现象，测定菌液的浓度。
3. 硝化菌培养：a. 取一定量的硝化菌接种于含有硝化菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为25℃），静置培养一段时间（一般为72小时）；c. 观察培养基是否出现颜色变化，测定菌液的浓度。
五、菌种应用1. 好氧菌的应用：好氧菌主要用于有机物的降解，可以应用于生活污水、工业废水等的处理过程中。
将培养好的好氧菌接种到污水处理系统中，通过菌群的作用，加速有机物的分解和降解，提高处理效果。
培养基资料
常用的配方是：亚硝化细菌培养基：硫酸铵0.5g 氯化钠0.3g 硫酸亚铁0.03g 磷酸二氢钠1g 硫酸镁0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000ml PH 7.5，固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基：亚硝酸钠1g 硫酸镁0.03g 硫酸锰0.01g 磷酸氢二钾0.75g 无水碳酸钠1g 磷酸二氢钠0.25g 蒸馏水1000ml PH 7.5，固体培养基加5％琼脂。
另外如果是用固体培养基倒置培养，可以适当多加些琼脂。
亚硝酸盐有毒，使用时要当心。
亚硝化细菌18分钟可繁殖一代，硝化细菌大约要15小时繁殖一代。
一般3-5天就会出结果，乳白色的菌落。
亚硝化细菌用格里斯试剂检测(出现红3天, 略微呈色)，硝化细菌用二苯胺检测（出现蓝色）。
第0天不呈蓝色; 第1~8天, 呈深蓝色, 而空白对照二苯胺试剂检蓝色; 第4天, 蓝色明显加深; 第5~测结果一直不呈蓝色。
活性污泥中的硝化细菌富集培养取得了预期结果, 自养硝化细菌成为优势菌群。
然后还要根据你的用途进行定向培育。
肉汤培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％1.2 实验方法1.2.1 硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。
1.2.2 形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。
（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。
1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。
一株好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及紫外诱变
一株好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及紫外诱变邵颖;陈安徽;董玉玮【摘要】从牛蒡(Arctium lappa L.)根际土壤中分离到1株具有较高反硝化能力的好氧细菌YB000,对该菌株采用生理生化及分子生物学方法进行了鉴定,并且对该菌株进行了以提高反硝化性能为目的的紫外诱变.结果表明,分离自牛蒡根际的反硝化细菌经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),该菌株于距离30W紫外灯30 cm处照射240 s可获得具有较强脱氮能力且遗传性状稳定的诱变菌株YB004和YB005,其脱氮能力分别达到93.43％、92.03％.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2016(000)013【总页数】5页(P3305-3309)【关键词】好氧反硝化细菌;牛蒡(Arctium lappa L.);根际土壤;筛选;鉴定;紫外诱变【作者】邵颖;陈安徽;董玉玮【作者单位】徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008【正文语种】中文【中图分类】X172随着水产养殖业的迅猛发展、含氮工业废水的排放及农业中化肥的过量施用，导致水体氮素含量严重超标而影响水体的使用安全［1，2］。
氮素超标是导致水体富营养化的重要原因之一，生物脱氮可有效去除水体中的氮元素［3］。
传统的生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程，反硝化脱氮能将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮转化为气态氮，从根本上解决水体中氮素超标的问题。
反硝化细菌是能够引起反硝化作用的细菌，多为异养、兼性厌氧细菌［4］，但近期研究表明，一些微生物在较高的氧分压条件下也能表现出反硝化能力［5-8］。
好氧反硝化作用实现了硝化和反硝化作用的同时进行，不仅简化了生物脱氮流程、降低了投资成分，而且还表现出了传统废水处理方法所无法比拟的优势，如硝化过程无需加碱中和、脱氮效率高、对氨态氮耐受能力强等［9］。
好氧反硝化细菌LKX－1的分离、鉴定及初步应用研究
好氧反硝化细菌LKX－1的分离、鉴定及初步应用研究刘立立;兰时乐;杨友才【摘要】A high efficient aerobic denitrifier was isolated from rice field to dispose the rural domestic sewage,then the strain was identified and its nitrogen removal effect was analyzed.The results showed that the strain was identified as Pseudomonas monteilii through analyzing the cell morphology,colony morphology, physiological and biochemical characteristics combined with 16S rDNA sequence.The preliminary studyon ni-trogen removal conditions of rural domestic sewage showed that with the glucose additive amount of 0.03%, inoculation amount of0.00015%,rotation speed of 120 r/min and cultural time of 48 hours,the removal rate of TN and NO -2 -N reached 91.55% and 96.33% respectively.%为筛选分离好氧反硝化细菌菌株用于农村生活污水处理，从水稻田中分离高效好氧反硝化细菌菌株，并进行鉴定及除氮效果分析。
结果表明，通过菌体、菌落形态特征和生理生化指标并结合16S rDNA 序列分析将该菌株鉴定为蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）；农村生活污水除氮条件初步研究结果表明，在葡萄糖添加量0．03％、接种量0．00015％、摇床转速120 r／min 和发酵处理时间48 h 条件下，总氮和亚硝酸盐氮去除率分别达到91．55％和96．33％。
一株好氧反硝化细菌的筛选及初步鉴定
一株好氧反硝化细菌的筛选及初步鉴定
黄运红;龙中儿;许杨
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2007(028)008
【摘要】从菜园贮粪池旁土壤中分离到1株以硝酸钾为氮源进行好氧反硝化作用的细菌,命名为NCDX-3.分离菌株革兰氏染色为阳性,球状,菌落颜色为土黄色,生理生化实验初步鉴定该细菌为海球菌(Marinococcus sp.).研究结果表明,在好氧条件下,分离菌株在硝酸盐初始浓度为1.288g/L的反硝化培养基中,培养7d,硝酸盐除去率达到75%,且反硝化作用主要发生在指数期.
【总页数】3页(P266-268)
【作者】黄运红;龙中儿;许杨
【作者单位】南昌大学,食品科学教育部重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学中德联合研究院,江西,南昌,330047;江西师范大学生命科学学院,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西,南昌,330022;南昌大学,食品科学教育部重点实验室,江西,南昌,330047;南昌大学中德联合研究院,江西,南昌,330047
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.99
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好氧反硝化菌
Microbiology China
tongbao@
NOV 20, 2010, 37(11): 1712 © 2010 by Institute of Microbiology, CAS
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好氧反硝化菌
邱并生
(《微生物学通报》编委会 北京 100101)
养殖水体氮素污染问题是目前困扰我国水产养殖业可持续发展的一大难题。生物脱氮技术被认为是目 前最具发展前景的水体脱氮技术, 其效果的优劣与所采用菌株的特性密切相关。 传统反硝化细菌仅能在厌氧 及低氧条件下发挥脱氮作用, 与养殖水体的高溶氧环境矛盾, 而好氧反硝化细菌则可在高溶氧环境中发挥 脱氮作用, 显著提高生物脱氮技术在养殖水体中的应用效果, 实现养殖水体的绿色、零污染脱氮。因而, 对 好氧反硝化细菌开展高效选育方法的研究, 找到可适应养殖水体水环境的微生物菌株具有重要的理论价值 和经济价值。 张小玲等 [1]采用间歇曝气、极限稀释和酸碱指示剂培养基相结合的办法, 从池塘底泥中成功分离到好氧 反硝化菌株 H2, 经生理生化和 16S rDNA 序列分析, 初步判断为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。在室内模拟养殖 水体中, 菌株 H2 在 15 d 时对亚硝酸盐和硝酸盐的最高降解速率分别达到 0.885 mg/(L⋅d)和 0.46 mg/(L⋅d), 试 验结束时, 总氮去除率达到 45.2%。结果表明, 菌株 H2 具有应用于养殖水体生物脱氮领域的巨大潜力。目 前, 该实验室已完成了好氧反硝化菌株 Bacillus sp. H2 的固体发酵工艺研究和相关产品的生产池塘应用试 验, 以此开发的生物脱氮制剂已在河南省中牟县、郑州郊区、荥阳、洛阳等 8 个地区进行了推广应用, 应用 水面达到 5 万多亩, 取得了良好的生态效益及经济效益。近年来国内相关研究相对活跃, 分离了多种好氧反 消化细菌 [2−15], 这对治理环境具有重要价值。 关键词: 好氧, 生物脱氮, 好氧反硝化
硝化细菌培养基配方及检测方法
硝化细菌培养基配方及检测方法
一、培养基
1、蛋白胨：1% 酵母膏：0.5% 氯化钠：1% 琼脂：2%
蒸馏水：100ml PH：7.2-7.5
2、土豆：20% 蛋白胨：0.5% 白糖：1% 葡萄糖：1%
混合无机盐：1% 琼脂：2% 自来水：100ml PH：7.0
3、蛋白胨：1% 牛肉膏：0.3% 氯化钠：0.5% 琼脂：2%
蒸馏水：100ml PH：7.0
二、测定步骤
1、样品稀释
从样品中准确称10.0g，加入90ml带玻璃珠数粒的无菌水三角瓶中，30℃水浴锅内，浸泡30-40分钟，拿出后反正摇各60次，即成10-1稀释液，立等用1ml无菌吸管吸中下层菌液1ml，移入装有9ml无菌水试管中，充分吹匀（约吹20余次），即成10-2稀释液，以此类推，连续稀释到10-6稀释液。
10-7试管内装8ml无菌蒸馏水，从10-6稀释液中吸取2ml菌液加入到装有10-7稀释液试管中，再用1ml移液管吹动20余次，取0.5ml菌液放入准备好的（装有培养基）培养皿内，用玻璃刮刀慢慢将菌液抹平（样品适宜的每个培养基做3个培养皿）。
2、培养
将培养皿倒放在35℃的培养箱内培养，从10小时开始计数，每隔1小时计数1次菌落，并用记号笔标注，防止菌落连成片无法数清，培养到48小时，培养结束（每个菌落的单位都是亿个/克）。
3、计算
累计每次三个平皿内菌落的平均数，相加就是这个样本的活菌含量，单位是亿个/克。
混合无机盐配方
硫酸铵：77% 磷酸二氢钾：15% 硫酸镁：8%。
1株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究
宋漫利，李 成，刘春敬，等．１株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１３）：２７１－２７５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１３．０６３１株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究宋漫利，李 成，刘春敬，梁致齐，李容臻，谢建治（河北农业大学资源与环境科学学院／河北省农田生态环境重点实验室，河北保定０７１００１） 摘要：为了提高污水处理设施的低温生物强化效果，以崇礼污水处理厂ＳＢＲ反应池活性污泥为菌源，进行污水处理耐冷菌的分离鉴定及固定化研究。
从活性污泥中分离筛选出１株硝化和好氧反硝化耐冷菌，结合生理生化、形态学以及１６ＳｒＤＮＡ基因测序结果，初步鉴定该菌株为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）。
以海藻酸钠（ＳＡ）和聚乙烯醇（ＰＶＡ）为包埋材料，利用正交试验优化ＮＬ－４包埋固定化制备条件。
当ＳＡ质量分数为１％、ＰＶＡ质量分数为１２％、ＣａＣｌ２质量分数为１％、包菌量为１０％时，制备的固定化小球物理性能最佳。
在１０℃培养条件下，ＮＬ－４对污水中氨态氮（ＮＨ３－Ｎ）和硝态氮（ＮＯ３－－Ｎ）的去除率分别是６８．０５％、９８．９４％，包埋固定化后分别提高了１４．４９％、１．４％。
４℃保藏６０ｄ后，比游离菌相比固定化载体的ＮＨ３－Ｎ、ＮＯ３－－Ｎ去除率分别提高５８．８％、５３．３％。
ｐＨ值为７～９、温度为１０～２０℃时，最适宜ＮＬ－４及其固定化载体发挥硝化、反硝化能力。
关键词：假单胞菌；聚乙烯醇－海藻酸钠（ＰＶＡ－ＳＡ）；好氧反硝化；包埋固定化；去除率 中图分类号：Ｘ７０２；Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１３－０２７１－０５收稿日期：２０１７－１０－１８基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项（编号：２０１５ＺＸ０７２０３－００５）；河北省高等学校科学技术研究青年基金（编号：ＱＮ２０１７０７６）；河北省博士研究生创新资助项目（编号：ＣＸＺＺＢＳ２０１７０７１）。
一种用于好氧反硝化细菌培养的长效培养基及其制备方法[发明专利]
![一种用于好氧反硝化细菌培养的长效培养基及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/48da34ffdb38376baf1ffc4ffe4733687e21fcbf.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710503531.6(22)申请日 2017.06.27(71)申请人 浙江浙大水业有限公司地址 310020 浙江省杭州市江干区秋涛北路253号411室(72)发明人 王兴祖 金少锋 林晓琴 吕晓莺 白渝梅 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公司 33109代理人 尉伟敏(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种用于好氧反硝化细菌培养的长效培养基及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种用于好氧反硝化细菌培养的长效培养基及其制备方法，按照本发明所述成分及制备方法可制得用于培养好氧反硝化细菌的长效培养基颗粒，通过实验，此颗粒可缓慢释放好氧反硝化细菌生长所需的营养，维持好氧反硝化细菌的长期高速生长，保持细菌的高生物量，从而只需初始接种1次，后续只需要45-60天左右更换培养基颗粒就可达到水质净化效果，可长期维持好氧反硝化细菌的生长繁殖及较高的生物量，制造方法简单，可机械化大规模生产；性质稳定，不需要特殊的保存环境；固体颗粒形态运输方便，不会因运输产生效力降低问题；将人工维护周期从1周延长到2个月，大大降低了人力及运输成本。
权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 107217021 A 2017.09.29C N 107217021A1.一种用于好氧反硝化细菌培养的长效培养基，其特征在于，培养基的组分以重量百份数计分别为：30-80份的淀粉、面粉中的一种或两种混合，0.1-10份的蛋白粉或氨基酸中的一种或两种混合，0.1-1份的磷酸钾、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾中的一种或几种混合，0.1-1份的硫酸镁，1-5份的麦饭石粉，5-50份的生物降解塑料，0.1-10份的偶联剂，0.1-10份的助剂，0.1-10份的热稳定剂，0.1-10份的保湿剂，0.1-10份的短切纤维与0.1-10份的分散剂。
好氧反硝化菌群的筛选及其培养条件的研究
本 文通过 梯 度法 添加 焦化废 水 的培养 基筛 选 、 驯化好 氧反 硝化 菌 ， 比较 单菌 株和 混合 菌群 的生 长情 并
况 和反 硝化 能力 ， 并研 究其 最适 培养 条件 ． 为工 业应 用 获得 抗 性较 强 、 长稳 定 、 硝化 能 力 强 、 生 反 适应 焦 化
文 章 编 号 ：６２２ ７ （０ ０ ０—０ ６０ １ ７ —４ ７２ １ ）２０ ３—５
好 氧 反 硝 化 菌 群 的筛选 及 其培 养 条 件 的研 究
孙 菲 方金 武 蔡 昌凤 ， 文玲 ， ， 赵
（． 徽 工 程 大 学 生 物 化 学 工 程 学 院 ． １安 安徽 芜 湖 ２ １０ ；． 湖 新 兴铸 管 有 限责 任公 司 ． 徽 芜 湖 ２ １ ０ ） ４ ００ ２芜 安 ４ ０ ２
＝２ ％（ ５ 菌液浓度 为（ —３ ×１ ｍＬ ． ２ ） Ｏ个／ ）经过筛选 和条件优化 ， 优势菌群 Ｎ —Ｎ去除率 达到 ９ ％ 的降解 ０ Ｏ
时 间 由 ９ ６ ｈ降到 １ ． ８ｈ 关 键 词 ： 氧 反 硝 化 菌 群 ； 选 ； 养 条 件 ； 化 废 水 好 筛 培 焦 文 献 标识 码 ： Ａ
废 水处 理 的好 氧反硝 化 菌群．
１ 材 料 公 司酚氰 污水 处理 站 （ ／ 淮 Ａ。 Ｏ工 艺） 沉池 活性 污泥． 二
试验 所用 焦化 废水 ： 湖市 新兴 铸管 厂焦 化 废水 生 化 处理 站 经 过气 浮 除 油 除渣 的 焦 化废 水 ， Ｏ 为 芜 Ｃ Ｄ
摘 要 ： 淮北 焦 化 厂 Ａ ／ 污 水 处 理 站 二 沉 池 的活 性 污 泥 中 ， 用 焦 化 废 水 配 制 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 固体 培 养 基 从 ｏ 采
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好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法
一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01
g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.
好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .
7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5.
富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取
降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证
所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）
细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态
氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、
KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、
MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝
(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节
pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 min
LB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、
FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·
7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 min
DM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41
g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌
20 min
采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
接种初筛菌株至LB 培养基，在30 ℃、160 r/min 条件下进行液体培养24 h 后，以10%的接种量接种到反硝化培养基(DM 培养基)中，30 ℃、160 r/min 条件下进行摇瓶发酵，间隔一定时间取样。
测定发酵液中硝基氮浓度(NO-3-N)和亚硝基氮浓度(NO-2-N)，通过分析其NO3--N 和TIN(NO--N+NO-2 -N)去除率，考察所筛菌株的反硝化性能。
NO-3 -N：用紫外分光光度法测定；NO-2 -N：用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定[4]。
菌体量：光密度法，用721 型分光光度计在600 nm 处测定吸光度值。
微量元素溶液:EDTA(乙二胺四乙酸) 50.0 g ,
ZnSO4 2.2 g , CaCl2 5.5 g , MnCl2·4H2O 5.06 g , FeSO4
·7H2O 5.0 g , CuSO4·5H2O 1.57 g , CoCl2·6H2O 1.61 g , 溶解后用蒸馏水定容至1 L ,pH 7.0.。