冰冻切片中常见的一些问题了解
冰冻切片注意要点
冰冻切片注意要点
1. 哎呀呀，做冰冻切片时可得注意温度呀！就好比冬天你穿少了会冷得要命一样，温度不合适切片质量可就差啦！比如上次小李做的时候温度没控制好，那结果，简直没法看！
2. 嘿，取材可太重要啦！这就像做菜选食材，得选新鲜合适的呀！你想想，要是选了个烂兮兮的材料做切片，那能好吗？之前小王就是随便取了个样，最后白忙一场！
3. 哇塞，切片的厚度可得掌握好呀！不能太薄也不能太厚，就跟包饺子皮似的，太厚了煮不熟，太薄了又容易破！那次小张切得太厚，后面观察都看不清啦！
4. 注意啦注意啦，固定一定要及时呀！这可不比你慢悠悠做事的时候，就像火灾了要赶紧灭火一样，晚了可就糟糕啦！我记得有一回有人没及时固定，那后果，不堪设想啊！
5. 哎呀，切片时动作得轻点呀！你对它温柔点，它才会给你好看的结果呀！就像抱小婴儿一样，粗暴可不行哦！上次有人太粗鲁，结果切片都被弄碎了！
6. 嘿哟，染色可别马虎呀！这就跟给画上色似的，要仔细认真呀！你看看，要是染得乱七八糟，那还能看出啥呀！之前有次染色没弄好，简直一塌糊涂！
7. 哇哦，封片也不能小瞧呀！好比给礼物包装一样，要包得严实漂亮呀！不然前面都白做啦！上次有人封片没做好，一下子就毁了！
8. 记住啊，操作环境得干净呀！这就像你住的房间，脏兮兮的可不舒服呀！有一回操作环境不干净，差点就毁了一组切片呢！
9. 总之，做冰冻切片真的要处处小心呀！每一个环节都不能马虎，不然就前功尽弃啦！大家一定要认真对待呀！。
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
冰冻切片制作及染色过程中常见问题及处理
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
2. 标本固定应充分
• 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
• 一般较多采用组织固定后再行切片 • 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
(1)所染的全部切片均为阴性结
果，包括阳性对照在内。 染
色
(2)所有切片均呈阳性反应
失
败
(3)所有切片背景过深
(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
• 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
• 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特 异性；切片孵育时间，湿度、温度；
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
冰冻切片的雷区，你中招了吗？
冰冻切片的雷区，你中招了吗？一、取材动物麻醉后，解剖迅速取出所需的新鲜组织，立刻转到固定液中固定，此步应尽可能快速完成，防止组织暴露在外因此后续检测结果。
二、脱水固定好的组织，转到15%蔗糖中脱水至沉底，再转到30%蔗糖中沉底即可。
注意：所用的固定液和脱水剂均是用PBS缓冲液来配制，如果不是，会破坏细胞膜的结构。
三、速冻1、将组织块平放于冰冻切片塑料模具内，缓缓加入包埋剂OCT 到模具内，避免引起气泡。
注意：需要切片的位置放到模具底部。
另外值得注意的是：一般在进行速冻之前，先用包埋剂浸没组织1-2h，然后在进行速冻。
2、用夹子夹住包埋好的组织放到液氮中，此时开始气化沸腾。
注意：包埋模具切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
注：要防止冰晶的产生，就是要控制组织的速冻过程，水的物理性质可知，水在-4度的时候，体积最大，这就说明了，如果水在-4度的停留时间越长，组织体内的冰晶体积就越大，数量就越多。
因此，我们要做好冰冻切片，防止组织出现空泡，就是要在速冻过程中，减少水停留在-4的的时间。
3、制成冻块后，即可置入恒冷冻切片机进行切片。
备注：若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
4、托台上涂一层OCT包埋胶，将速冻好的组织置于涂好OCT的托台上，放上铁压台，利用重力压平组织。
四、切片1、把冷冻好的组织承载器装到仪器的进退键上，手工旋转旋钮，观察是否固定好。
2、调好切片厚度，修片，修到需要的位置再切，恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，切片机置于低温密闭室内，切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-20μm，一般切10um既可。
3、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -22℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
注意：包埋剂的选择，包埋剂是对冰冻切片的质粒是一个重要的影响因素，常规的包埋剂有OCT剂，B超耦合剂和普通的胶水；其中B超耦合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织，普通胶水和OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬的组织。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冷冻切片注意事项
冷冻切片注意事项冷冻切片是一项很有趣但也需要特别小心的工作呢。
一、切片前的准备。
1. 样本的处理可不能马虎。
拿到样本的时候，要像对待宝贝一样。
如果是组织样本，要确保它的新鲜度，就像你去市场买新鲜水果一样，新鲜的样本才能切出好片子。
如果样本在运输或者保存过程中有什么磕磕碰碰，或者被污染了，那可就麻烦啦，就像做饭的时候食材坏掉了，后面再怎么努力也很难做出美味佳肴。
2. 冷冻机的状态要调整好。
要把冷冻机当成自己的小宠物一样去照顾，温度要设置准确。
温度太高，样本冻不好，切的时候就会软趴趴的；温度太低呢，样本又会变得像冰块一样硬邦邦的，容易碎掉。
这就好比你穿衣服，穿多了热得难受，穿少了又冷得发抖。
3. 刀具的选择和检查也很重要。
刀具就像是战士的武器，要选一把锋利又合适的。
如果刀具钝了，那切出来的片子就会坑坑洼洼的，就像用钝刀切面包一样，切得乱七八糟。
而且在切片之前，一定要仔细检查刀具有没有损坏或者脏东西，不然这些都会影响切片的质量。
二、切片过程中的要点。
1. 操作的时候要稳。
这就像走钢丝一样，手不能抖。
一旦手抖了，切出来的片子厚度就不均匀了，可能这边厚那边薄，就像一边是小山丘，一边是小山谷。
而且在切的时候，要保持一个合适的速度，不能太快也不能太慢。
太快了容易切歪或者切坏样本，太慢了样本可能会因为局部温度升高而变形。
2. 要注意样本的摆放。
样本在切片台上要放得端端正正的，就像小朋友在课堂上坐得笔直一样。
如果样本放歪了，切出来的片子形状就会不规则，就像歪着切蛋糕，切出来的蛋糕块奇形怪状的。
3. 切片的厚度要控制好。
不同的实验或者观察需求，对切片厚度有不同的要求。
这就像做菜放盐一样，放多放少都不行。
如果切片太厚，可能会影响观察的清晰度，就像隔着一层厚玻璃看东西模模糊糊的；如果切片太薄，又可能会把样本切坏或者在后续处理过程中容易丢失。
三、切片后的注意事项。
1. 切片后的保存要得当。
切好的片子就像你精心制作的小手工一样，要好好保护。
冰冻切片常见问题分析与预防
有 充分 的时 间排 除冷 空 气 ， 能放 气过 快 ， 不 一般 约需 十
分钟 左 右 ， 或据 肉眼 观察 排气 孔 有雾状 气 体 排出为 止 。
同时 也 应根据 温 度指 示 表 等 ， 冷空 气 充 分 排 尽后 方 待
能 进 行消 毒灭 菌 。 ２ 物 品摆 放要 合理 高压蒸 汽 灭 菌器 内的 消毒物 品 的摆 放直接 影 响蒸 气 的穿透 因此 ． 品摆 放 一定要合 理 ， 物 相互 问要 有空
度， 与按 正 常速 度 加 热 ， 其 在 ２ 分 钟 后 达到 灭 菌 要 使 ０ 求 的温度 ， 如果 按 相 同 的灭 菌时 间计 算 ， 加热 过快 ， 有 效 灭 菌持续 时 间较 短 ， 因此 直接 影响 灭菌 效果 。
菌要求 的压 力 ， 担蒸汽 温度 未 能达 到要 求 的高度 ， 致 导
２ 粘附 剂 的选择 冰 冻切 片组 织粘 附 剂 ， 以不含 水分 的最 佳 。 目前普
冰冻切 片是 借 助低 温使 组织 快 速 冻结达 到一 定 的
硬度 进行 切 片的 一种方 法 但 由于 各 种原 因影 响冰 冻
切 片 的 质 量 ， 直 接 影 响 了 病 理 诊 断 的 及 时性 、 确 就 准 性 因此 ， 能否 一 次制 成优 质冰 冻 切片 是极 其重要 的 。 现 将 在冰 冻切 片技 术 １ 作 中 的常 见问题 作 如下分 析 ： 二 ｌ 送检 标本应 注 意 的问题
浅析冷冻切片常见的质量问题及处理方法
大密度投影（ Ｍ Ｉ Ｐ ） 图像上 画线 ， 重组 出单体素的曲面图像 。 曲面
重组的优点是可 以将弯 曲的肋 骨重组在一个断面 图像显示 ， 不 受周围组织的干扰［ ４ １ 。Ｖ Ｒ利用了容积 内的全部信息 ， 将扫描容 积 内投影线通过容积数据 的全 部像 素总投影 ， 以不 同灰 阶显示
浅 析冷 冻切 片 常见 的质 量 问题 及 处 理 方 法
杨 国霞
（ 中信机电制造公司总医院 ， 山西 运城 ０ ４ ３ ８ ０ １ ）
冷冻切 片是 指借助低温 条件对 尚未 固定 的手术切 除标本
组织块 快速冷冻 ， 达到一定 的硬度 之后 ， 进行切 片 的一 种制片
织块过大或偏位等 四种状况。
【 ３ ］ 姚 以刚． ６ ４ 层容积 ｃ Ｔ 对肋 骨骨折 的诊断价值 们． 中国 ｃ Ｔ和 Ｍ Ｒ Ｉ
杂志 ， ２ ０ ０ ９， ７ （ ４ ） ： ３ ９ — ４ １ ．
组３ ２ 例， 发现不完全 Ｉ 生骨折 ５ 处、 无移位的完全型骨折 ４处。 总之 。 ｌ ６层螺 旋 Ｃ Ｔ对肋 骨骨折 的诊 断价值 明显优 于 Ｄ Ｒ 胸片， 图像后处理发挥 了其优越性 。其 中 Ｖ Ｒ图像直观 ， 近似解 剖位置 ， 对肋骨 骨折 的位 置 、 数量 和移位 情况显示清楚 ， 但 对微 细骨折确诊需结合原始 薄层图像及 Ｃ Ｐ Ｒ重建 图像 ， 可检 出 Ｄ Ｒ 平片不易发现的骨折 ， 确 定骨折的部位 、 范围 、 类 型及 与周围组
参考文献
结构 ， 但Ｖ Ｒ图像对 肋骨骨皮质微 细裂 折不能确诊 。曲面重组
成像在显示肋骨骨质内在结构及微细骨皮质裂折方面有独特价 值目 ， 可多次重复重组 图像 ， 直至骨 折线显示最佳 。本组病例 均 行冠状位 和矢状位平 面重组 ， 再行 Ｖ Ｒ重组 ， 作出基本诊 断 ； 对
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
脱蜡试剂的问题
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怎样使 切片染色更漂亮
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液： 苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水
730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml. （2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
废液倒掉后，试剂瓶要清洗干净并且擦干。 更换试剂后要预先试染一批切片。 更换试剂时要注意不要弄错试剂摆放的顺序。 由于天气的原因，试剂容易挥发，要及时添加或更换。
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细节决定成败
在常规和冰冻切片制片过程中，切片染 色也是 比较重要的一个环节，如果这个环节没做好，也一 样地影响病理诊断，所以，我们在实际工作中除了 注重常规的组织标本的前期处理、冰冻切片的速冻 方法外，我们还要正确选择染色液的配方，并且在 染色过程中把每一个细节都做得很好，我们的切片 质量肯定会好的。
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2、 取材不能太大、太厚
组织块的大小、厚 薄决定了冷冻的速度， 太大、太厚的组织由 于冷冻时间长，难免 有冰晶的产生。所以， 取材组织块小于 1.5*1.5*0.3cm。
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取材3mm 厚
取材4mm厚
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3、使用吸水纸 可以吸干组织表面的水分
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4、样本托和打底胶预冷
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打底胶预冷
常规及冰冻切片制片中常见的 问题分析及解决方法
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常规、冰冻制片常见问题及对策
冰晶的问题----冰冻切片制片时如何减少冰晶 染色的问题----怎样使切片染色更漂亮 标本切开与固定----如何做好标本的切开与固
冰冻切片中常见问题分析ppt课件
8、组织块脱落：
冷冻切片一般要求在30min内发出病理报告，以便手术医 生能尽快选择手术方式。但若组织块脱落，会拖延病理报 告发出的时间，而耽误病人的手术时间。常见原因有：① 冻头在冷冻机内放置时间过长，致使包埋胶还来不及渗到 冻头的底部便凝固了，导致包埋胶与冻头粘连不紧，稍受 外力的作用便脱落；② 冻头上的包埋胶冲洗不干净。
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总之，对于冰冻切片的质量因素主要 有以上几点。如果能正确对待以上几 方面的问题，冰冻切片的质量方可得 到保证，且能制备出一张质量优秀的 切片，为明确病理诊断提供较为便利 的客观条件。
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预防及处理方法：避免组织内带有坏死组织，条
件允许者重新取材；若没有组织可代替，切片固 定时间长些，经95％乙醇双重固定后，用电吹风 将切片吹干（温度不能过高，以防破坏组织结构） 然后再进行染色且动作应轻柔。② 定期更换固定 液。一般每周更换一次，例数较多者，适当增加 次数；另外，每次做完冷冻，应及时将盛固定液 的瓶盖盖好，以防固定液挥发而降低其浓度。③ 保持载玻片干净，平时应将玻片盖好，防止灰尘 或其它异物的污染。若新购买的玻片较脏，洗涤 过后才使用。④ 调好切片的厚度，切片厚度以 5～7um较为合适（脂肪组织可稍为厚些）。
冰冻切片中 常见问题分析
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在Pa冻ge 2头的中央。
冷冻切片要注意什么
冷冻切片要注意什么冷冻切片是一种常见的切片方法，常用于生物组织的切片，以便于后续的检测和分析。
在进行冷冻切片时，需要注意以下几点：1. 样品的准备样品的准备是冷冻切片的首要步骤。
样品的处理方法可能会因为样品的来源和需要的扫描方法等因素而有所不同。
总的来说，常见的样品处理方式包括特定的固定液处理、涂覆有机材料等。
如果样品过于薄或过于厚，都会对切片效果产生影响。
因此，在切片前要确保样品质量良好，且符合所需要求。
2. 切片的温度在冷冻切片的过程中，样品温度是需要进行严格控制的，同时，也要保证切片设备的温度稳定。
一般情况下，冷冻切片的温度在-20到-50之间，具体温度要根据样品的情况进行调整。
在样品切割过程中，切片机要保持足够的冷却能力，以保证切片的质量。
如果切片机温度不足，可能会导致样品破裂或切片不均匀。
3. 切片机的选择不同的样品和切片要求需要不同的切片机。
对于较硬的样品或者需要制作大量薄切片的情况，选择稍微强一点的轮廓切片机。
对于一些细胞和肌肉等柔软的样品，可以使用冷冻微扫描切片机，以获得更高清晰度的切片效果。
4. 切片后的保存切片后要进行保存，以便后续进行染色和显微镜分析等操作。
不过，一定要注意样品的保存条件。
保存时，要避免温差过大、光、氧气或潮湿等环境影响，同时要遵循防止细菌和霉菌污染的措施，以确保样品的稳定性。
冷冻切片的现代CCD摄像机和显微镜能力很大程度上depends on 选择的样品制备方法。
为了实现这种高功率，必须注意上述几点的细节。
与传统切片技术相比，冷冻切片技术有更多精确测量的优势。
但由于这项技术的复杂性，需要耗费很多时间和精力来管理。
只有在细致的样品准备、精度正确的设备和适当的卫生条件下，才能获得最佳的冷冻切片效果。
冰冻切片制作体会及常见问题对策
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冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
加强操作人员技能培训与交流学习
总结词
加强操作人员技能培训和交流学习可以提高冰冻切片 制作和染色技术的水平。
详细描述
操作人员的技能水平对冰冻切片制作和染色结果具有 重要影响。因此，应加强操作人员的技能培训，使其 掌握正确的操作方法和技巧。此外，组织操作人员之 间的交流和学习，可以分享经验和技巧，提高整体技 术水平。同时，鼓励操作人员积极参与学术会议和技 术研讨会，了解最新的技术和进展，也是提高技术水 平的有效途径。
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冰冻切片染色常见问题及 处理方法
染色不均匀
总结词
冰冻切片染色不均匀可能是由于染色时间不足或过长、染色液浓度不合适、切片温度不均匀等原因引 起的。
详细描述
染色不均匀的问题可以通过控制染色时间和浓度来解决。一般来说，染色时间不宜过长或过短，应根 据染色液的浓度和切片厚度来适当调整。同时，确保切片温度保持均匀，避免局部温度过高或过低。
详细描述
在冰冻切片制作过程中，组织固定 是关键步骤之一。如果固定不当， 会导致细胞结构变形、组织结构松 散等问题。
处理方法
应掌握组织固定的最佳时间和方法 ，根据组织类型和实验要求选择合 适的固定剂，并严格控制固定时间 。
切片温度不适宜
总结词
切片温度不适宜可能引起细胞结 构破坏，影响切片质量。
详细描述
感谢您的观看
THANKS
总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求 ，选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚 度。一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过 薄的切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时 ，应根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以 确保染色效果。
关于冰冻切片的若干问题
问：【1】本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。
因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。
祝好运吧！2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因.答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题:30%的蔗糖脱水过夜----一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT包埋、液氮冷冻。
只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。
3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成冰冻切片心得1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.如果是全脑的话，放在30%蔗糖（PBS或PB配）中沉底会很慢，我们都用双蒸水配，先20%沉底，再30%沉底，想要沉底快可将脑先切成小块。
常规冰冻制片常见问题分析湘雅医院病理科付春燕
中南大学湘雅医院病理科的问题----冰冻切片制片时如何减少冰晶
• 染色的问题----怎样使切片染色更漂亮
• 标本切开与固定----如何做好标本的切开与固定
一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。 所以良好的冰冻切片制作取决于标本的冷冻速 度，要想组织在冷冻过程中不产生或者少产生冰 晶，就必须 使组织快速冷冻，而且冷冻得越快越 好。
2、注意染色的细节
• 脱蜡彻底（热片和震动） • 染色前用滤纸刮去苏木素液表面的氧化膜
• 苏木素染色（过染）、分化，蓝化、镜下观察，流水冲 洗10分钟以上 • 分化液为0.5%盐酸酒精 • 伊红过染时，可用70%酒精洗至理想颜色 • 染色时要注意试剂的量是否足够 • 手工染色时，为了保证各缸试剂的浓度 ，尽量不要把前 一缸的试剂带入后一缸内 • 使用新鲜的试剂，定期更换染色试剂
二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
脱蜡试剂的问题
怎样使 切片染色更漂亮
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方
2、注意染色过程中的细节问题
1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液： 苏木 2.5 克溶于乙二醇 250ml 中。硫酸铝铵 17.6 克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加冰 醋酸20ml.
染色试剂的更换
• 除了二甲苯换掉第一缸，后面的二甲苯往前移外，其他的 试剂都换新的。 • 废液倒掉后，试剂瓶要清洗干净并且擦干。 • 更换试剂后要预先试染一批切片。 • 更换试剂时要注意不要弄错试剂摆放的顺序。 • 由于天气的原因，试剂容易挥发，要及时添加或更换。
冰冻切片的步骤及注意事项
冰冻切片的步骤及注意事项嘿，友友们！今天咱来唠唠这冰冻切片的那些事儿，可别小看它哟，这里头的步骤和注意事项那可不少呢！
先说这第一步，取材那可是相当关键呐！就好比你要做一道超级美味的菜，原料得新鲜吧！取材的时候就得眼疾手快，别磨蹭，不然那材料都不新鲜啦！而且取的位置也得准，不然切出来的片子可就不地道喽。
然后就是速冻啦，这就像是给材料来个急速冰镇。
嘿，可别慢悠悠的，得赶紧把它冻得邦邦硬，不然切片的时候可就不好玩啦。
想象一下你切个软不拉几的玩意儿，那能成啥样！
接着就是切片啦，这可是个技术活。
就跟咱削苹果似的，你得手法稳，不然切出来那一片片厚的厚，薄的薄，那可不行！我跟你说，这时候就得开启“大师模式”，每一刀都得恰到好处，别整那些歪七扭八的片子出来。
哎呀，这过程中可得注意好多事儿呢。
比如说温度得控制好，太高了不行，太低了也不行。
温度不对，那切出来的片子不是皱皱巴巴就是碎成渣，这可不是咱想要的结果嘛。
还有呢，切片机也得爱护好，就跟咱的宝贝似的，不然它捣乱起来，你可就有的愁喽。
有时候啊，这冰冻切片就跟一场战斗似的，你得和各种因素斗智斗勇。
一不小心哪里出点差错，那片子可不就给你颜色看啦！但咱也不能怕呀，就得勇敢面对，慢慢摸索，找到最佳的方法。
我还记得刚开始接触冰冻切片的时候，那真叫一个手忙脚乱啊。
不是这儿出问题就是那儿不行，简直让我哭笑不得。
不过呢，随着经验的积累，现在咱也能轻松应对啦。
总之呢，冰冻切片虽然有些麻烦，但只要咱掌握了步骤和注意事项，加上那么一点点的耐心和细心，就一定能把它搞定！友友们，加油干吧，让我们在冰冻切片的世界里闯出一片天！。
冰冻切片的原理、流程和注意事项
冰冻切片的原理、流程和注意事项1冰冻切片的原理冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理，不需要石蜡包埋，直接在低温恒冷切片机冷冻后马上进行切片的一种方法。
冰冻切片具有操作简单、对环境污染小和对组织抗原损伤小的特点。
又因制作时间和材料有限，保证高质量的冰冻切片非常重要，直接影响病理诊断的正确率。
2冰冻切片的操作流程整体流程：送检和取材要求：•送检标本及时新鲜，组织无需固定，不能遇水，防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生•取材的器械要保持干燥，取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域•所取组织块大小应合适。
组织过大切片时阻力加大，难免产生刀痕及褶皱，加大了制片的难度包埋：•包埋剂一般使用OCT或普通胶水•包埋时将包埋剂涂抹均匀，并根据组织情况和医生的要求确定包埋方向，如管腔、皮肤、囊壁等要立埋•组织体积较小，可先挤入少许胶在包埋托上形成一个”平台“，再放入小组织进行包埋冰冻温度与时间：冰冻的温度与时间时制作冰冻切片的关键因素，需要根据组织的种类、厚度和大小来调节。
如果温度过低，会造成组织过硬、切片破碎；温度过高会造成组织硬度不够，难以切片切片和染色：•在组织和包埋机冻到发白后可以开始切片•是否使用防卷板可根据操作者的习惯，如使用防卷板，一般将其调整到与切片呈5度夹角•切片时右手摇轮转要力道均匀、柔和、缓慢，切片厚度掌握在5微米，左手持毛笔在切片形成时按住组织边缘，使其不发生卷曲•将切片展平粘贴在结晶载玻片上后，应当立即放入固定液中加以固定，如固定不及时，会发生细胞蜕变，切片中细胞核显示不清，呈”云雾状“表现冰冻切片HE染色流程：3冰冻切片的注意事项1. 组织取材要规范冰冻切片的组织要尽可能新鲜，不触碰谁，取材要及时，动作要迅速。
2.取材大小要厚薄适中在确保渠道主要病变的前提下，尽量避开钙化、坏死、脂肪等。
3. 保持取材台面和器材的干净，防止污染4. 组织表示及编号要明确5. 切片固定要及时制片过程要求快速冷冻、快速切片、快速固定。
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总之，对于冰冻切片的质量因素主要 有以上几点。如果能正确对待以上几 方面的问题，冰冻切片的质量方可得 到保证，且能制备出一张质量优秀的 切片，为明确病理诊断提供较为便利 的客观条件。
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5、冰晶的形成对制片的影响：
此原因主要取决于组织含水量的大小，尤以组织细胞水肿， 淋巴结，纵隔肿瘤，卵巢肿瘤为甚，送检取材过程中接触 水源，速冻过程中使用的液氮时间尚未控制好，同是造成 冰晶形成的原因，其解决方法为，使用液氮时间上控制到 位，保证一次冻透标本，组织送检取材时，尽量避开水源， 如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行 冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。操作者的动 作应迅速。
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2、冷冻时间对制片的影响：
根据组织块的大小、性质，确定冷冻时间，一般13～17s （使用液氮者），若组织较大或脂肪组织时间可适当长些， 而甲状腺、脑组织和淋巴组织等冷冻的时间相对要短些。 冷冻时间要严格掌握，时间过长，切片易脆碎，其处理方 法是：切出完整平面后用戴乳胶手套的拇指按压回温，直 到切片完整为止，反之，时间过短，则需继续冷冻，直到 组织不粘刀片出现完整切片为基准。
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7、切片脱落：
冷冻切片是利用温度差（即玻片与组织切片的温度差）将 切片粘贴在玻片上，然后进行固定、染色。下面几种情况 下可影响切片粘贴的牢固程度，而导致切片脱落：① 组 织内含过多的坏死组织。组织细胞坏死崩解后，局部的渗 透压升高，吸收水分，切片一经固定，水分逸出，坏死组 织失去支撑作用，染色时组织容易脱落。② 固定液浓度 过低，这是最常见的原因。③ 载玻片不干净。④ 切片太 厚。
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3 、冷冻箱体工作温度对制片的影响：
一般组织设定为－18～－20℃。但对一些较特殊的组织 标本，温度应适当调整，如脂肪成分较多的组织以－30～ －35℃为宜，纤维腺瘤，子宫等为－20℃，淋巴结，甲 状腺为－18℃，切片时，表面玻璃机器盖子不要打开过大， 以免箱体回温过快，影响制片。保持冻箱的温度，做到每 次做完冷冻切片应关好冷冻箱的盖子。
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预防及处理方法：避免组织内带有坏死组织，条
件允许者重新取材；若没有组织ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ代替，切片固 定时间长些，经95％乙醇双重固定后，用电吹风 将切片吹干（温度不能过高，以防破坏组织结构） 然后再进行染色且动作应轻柔。② 定期更换固定 液。一般每周更换一次，例数较多者，适当增加 次数；另外，每次做完冷冻，应及时将盛固定液 的瓶盖盖好，以防固定液挥发而降低其浓度。③ 保持载玻片干净，平时应将玻片盖好，防止灰尘 或其它异物的污染。若新购买的玻片较脏，洗涤 过后才使用。④ 调好切片的厚度，切片厚度以 5～7um较为合适（脂肪组织可稍为厚些）。
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组织内含过多的脂肪或坏死组织：脂肪或坏死组织较一般 的组织冷冻的温度要低些，当活组织达到所需的温度时， 其还比较软，从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出 的时间。 组织块过冷：组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状，不 能制作一张完整的切片。
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组织块冷冻不均匀：在配合使用液氮时，组织块放入液氮 时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下，可产生此现 象。 冻头的温度不足：冷冻切片时要求冻头的温度保持在－ 25℃～－30℃左右，冻头的温度达不到要求时，组织很 快回软，也不能保证切片的完整。
冰冻切片中 常见问题分析
临安人民医院
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在冻头的中央。
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4、染色对制片的影响：
尤以细胞核的染色最为关键，在寒冷的冬季，室温过低时， 影响核的着色，可适当加温，用以增色，苏木素的酸碱度 应适宜，经常观察其染液的ph值，过碱时应及时更换，盐 酸酒精分化适度，时间控制到位，否则易造成核着色不佳， 染色质不清晰，影响诊断的准确性。
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8、组织块脱落：
冷冻切片一般要求在30min内发出病理报告，以便手术医 生能尽快选择手术方式。但若组织块脱落，会拖延病理报 告发出的时间，而耽误病人的手术时间。常见原因有：① 冻头在冷冻机内放置时间过长，致使包埋胶还来不及渗到 冻头的底部便凝固了，导致包埋胶与冻头粘连不紧，稍受 外力的作用便脱落；② 冻头上的包埋胶冲洗不干净。
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6、切片皱缩或卷缩：
这也是影响切片质量的重要因素之一。常见的原因有：① 刀锋变钝。② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切 片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。 ③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋 不完全，缺乏支撑作用。 预防与处理的方法：① 注意检查刀具，及时更换刀口， 定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片， 均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱 缩。③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷 板比刀锋前0.2㎜左右。④ 包埋组织应完全，没法切片者 再滴加包埋胶。