高精度核酸检测技术 - 袁汀
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肝炎病毒PCR检测技术国内现状及最新进展
HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义
主要内容
Part Part Part Part
Ⅰ
荧光定量PCR技术简介 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 临床对HBV/HCV检测技术的需求 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Part Ⅰ
PCR技术简介
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。
Part Ⅱ
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙型肝炎检测标志物
☆ HBsAg, 抗-HBs,
☆ HBeAG,抗-HBe, ☆抗-HBc（IgG,IgM）, ☆ HBV-DNA
测
克隆测序
反向线性杂交 PCR-RFLP 基因芯片
可预防或延缓核苷类似物耐药变异
耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
鉴别HBV病毒A-H8个基因型 基因分型检测 同上 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同
核裂变链式反应
“链式反应”改变世界
PCR技术简介
PCR技术的诞生
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
பைடு நூலகம்
•1971：Khorana等提出在体外经DNA变性、引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸DNA的设想。 •1983：Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实 现。 •1988：耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 •1993：Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
急性乙型肝炎各项生理指标
4-12 周
1-2周 2周－ 3 月
3 － 6月 血清学 转换期
潜伏 期
潜伏 后期
急性 急性期 早期
康复期
痊愈
标 志 物 相 对 浓 度
Anti -HBc HBsAg Anti-HBc IgM DNA HBeAg Anti -HBe Anti -HBs
•实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物 的增加,直观地看到反应的对数期 •降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的
特异性
•增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 •结果分析更加快捷方便,无需跑胶
PCR技术简介
PCR的应用
检测种类 检测方法 RNA-cDNA-PCR 定性检测 血筛（输血、生物制品） HCV-RNA检测 直接RNA扩增（NASBA） 定量检测 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR 焦磷酸测序 克隆测序 鉴别HcV病毒6个基因型 初始治疗依据 治疗检测、疗效评估、方案调整 预后评估（基线水平、RNA变化） 临床意义 确诊HCV感染（特别是移植、血透、HIV合并）
有传染性
可能有传 染性
有免 疫力
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙肝病毒的检测方法
☆ 免疫学检测 ☆ 生物化学检测 ☆ 组织学检测 ☆ 分子生物学检测 ☆ 基因芯片
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV分子生物学检测
☆ HBV-DNA ☆ 基因耐药突变检测 ☆ 基因分型
☆ HBV前C及核心启动子变异
荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行 标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果 进行分析,计算待测样品的初始模板量。 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
PCR技术简介
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
前C区及核心区启
动子（BCP）突变 检测 同上
与疾病预后有关，肝硬化及原发肝癌中均高
发生核苷酸类似物耐药突变的危险因素
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
丙肝病毒的检测方法
☆ 血清生化学检测
☆ HCV抗体检测
☆ HCV核心抗原检测
☆ HCV RNA 检测
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HCV分子生物学检测方法及临床意义
1、目的基因的克隆：
PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变：
可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析 的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的 检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
PCR技术简介
PCR原理：实质就是体外基因复制技术
PCR技术简介
30次循环后靶序列扩增的数量
10亿
PCR技术简介
PCR技术分类
常规PCR
在PCR结束后对终点产物进行分析。
巢式PCR 多重PCR PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术
PCR技术简介
病原学检测常用的实验室技术
☆ 细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 ☆ 血清学、免疫学诊断技术
☆ 电镜技术
☆ 分子生物学诊断技术——PCR
PCR技术简介
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶
PCR技术简介
PCR技术简介
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
The New York Times as "highly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R."
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
实时荧光定量PCR
bDNA HBV-DNA检测 竞争PCR 杂交捕获
确诊HBV感染
病始治疗方案确定 治疗过程动态监测 抗病毒治疗选择及监测 预后评估
PCR产物直接测序 焦磷酸测序
可提高初始治疗效果
基因耐药突变检
HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义
主要内容
Part Part Part Part
Ⅰ
荧光定量PCR技术简介 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 临床对HBV/HCV检测技术的需求 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Part Ⅰ
PCR技术简介
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。
Part Ⅱ
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙型肝炎检测标志物
☆ HBsAg, 抗-HBs,
☆ HBeAG,抗-HBe, ☆抗-HBc（IgG,IgM）, ☆ HBV-DNA
测
克隆测序
反向线性杂交 PCR-RFLP 基因芯片
可预防或延缓核苷类似物耐药变异
耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
鉴别HBV病毒A-H8个基因型 基因分型检测 同上 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同
核裂变链式反应
“链式反应”改变世界
PCR技术简介
PCR技术的诞生
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
பைடு நூலகம்
•1971：Khorana等提出在体外经DNA变性、引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸DNA的设想。 •1983：Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实 现。 •1988：耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 •1993：Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
急性乙型肝炎各项生理指标
4-12 周
1-2周 2周－ 3 月
3 － 6月 血清学 转换期
潜伏 期
潜伏 后期
急性 急性期 早期
康复期
痊愈
标 志 物 相 对 浓 度
Anti -HBc HBsAg Anti-HBc IgM DNA HBeAg Anti -HBe Anti -HBs
•实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物 的增加,直观地看到反应的对数期 •降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的
特异性
•增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 •结果分析更加快捷方便,无需跑胶
PCR技术简介
PCR的应用
检测种类 检测方法 RNA-cDNA-PCR 定性检测 血筛（输血、生物制品） HCV-RNA检测 直接RNA扩增（NASBA） 定量检测 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR 焦磷酸测序 克隆测序 鉴别HcV病毒6个基因型 初始治疗依据 治疗检测、疗效评估、方案调整 预后评估（基线水平、RNA变化） 临床意义 确诊HCV感染（特别是移植、血透、HIV合并）
有传染性
可能有传 染性
有免 疫力
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙肝病毒的检测方法
☆ 免疫学检测 ☆ 生物化学检测 ☆ 组织学检测 ☆ 分子生物学检测 ☆ 基因芯片
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV分子生物学检测
☆ HBV-DNA ☆ 基因耐药突变检测 ☆ 基因分型
☆ HBV前C及核心启动子变异
荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行 标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果 进行分析,计算待测样品的初始模板量。 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
PCR技术简介
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
前C区及核心区启
动子（BCP）突变 检测 同上
与疾病预后有关，肝硬化及原发肝癌中均高
发生核苷酸类似物耐药突变的危险因素
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
丙肝病毒的检测方法
☆ 血清生化学检测
☆ HCV抗体检测
☆ HCV核心抗原检测
☆ HCV RNA 检测
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HCV分子生物学检测方法及临床意义
1、目的基因的克隆：
PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变：
可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析 的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的 检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
PCR技术简介
PCR原理：实质就是体外基因复制技术
PCR技术简介
30次循环后靶序列扩增的数量
10亿
PCR技术简介
PCR技术分类
常规PCR
在PCR结束后对终点产物进行分析。
巢式PCR 多重PCR PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术
PCR技术简介
病原学检测常用的实验室技术
☆ 细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 ☆ 血清学、免疫学诊断技术
☆ 电镜技术
☆ 分子生物学诊断技术——PCR
PCR技术简介
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶
PCR技术简介
PCR技术简介
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
The New York Times as "highly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R."
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
实时荧光定量PCR
bDNA HBV-DNA检测 竞争PCR 杂交捕获
确诊HBV感染
病始治疗方案确定 治疗过程动态监测 抗病毒治疗选择及监测 预后评估
PCR产物直接测序 焦磷酸测序
可提高初始治疗效果
基因耐药突变检