间接免疫荧光法

活细胞间接免疫荧光法
1 转染细胞4h后，用PBST洗涤三次。

2 固定。

用置于-20℃预冷的甲醇进行固定，500 ul/孔，室温作用10 min。

用PBST洗涤三次。

3 封闭
4 一抗加入1：100倍稀释的阳性血清（用1%的BSA稀释）200 ul/孔，37℃作用1h。

用PBST 洗三次
5 二抗加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY(用1%的BSA稀释)，200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次。

6 荧光显微镜下观察结果。

转染Vero 细胞4h后，用PBST洗涤三次，用置于-20℃保存的冷丙酮(丙酮：乙醇=2：3)进行固定，500uL/孔，室温作用10min。

用PBST洗涤三次，加入1：100倍稀释的ARV阳性血清200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次，加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY，200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次
一．实验器材：
1．器材：
40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等。

2．试剂：
单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、叠氮钠（NaN3）等。

二．方法（微量法）
1．将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。

用含0.1% NaN3PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml（5000万-1亿/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗（第一抗体）50ul（同时加入AB型血清5ul）振荡混匀，置4℃，至少30分钟。

2．用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。

3．加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。

4．用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。

如想次日看结果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔50ul，混匀置4℃过夜，次日离心弃上清按四步做法观察结果（为膜荧光）。

细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法
细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。

操作方法
1. 取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；
3. 余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤（2）；
注意事项
1. 在使用前，一抗二抗均应测试其合适的稀释度。

2. 多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后，应再用去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，则会使交联结构解体。

因此，应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。

3. 信号微弱的解决方法：
①提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性，这必须测试各种浓度抗体的滴度；
②延长一抗和二抗的孵育时间。

由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上，抗原抗体结合时间较在溶液中长。

孵育时间可因实验设计作适当调整，但少于20min抗体和抗原几乎不能有效结合。

在以上两点中，应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。

这就需要反复试验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同；
③改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性。

4. 背景不好的解决方法
细胞样本进行荧光染色时，背景问题主要来自两个方面，即非特异性染色和特异性交叉反应。

①非特异性吸附：非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。

即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附，而不是与抗原发生特异性结合。

*将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100，000′g离心30min以去除蛋白聚合物。

*滴定一抗和所用的检测试剂，以确定能够产生合适信号的最低浓度。

*固定后，用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品，有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。

*用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。

*固定后，在所有的缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20。

*缩短一抗或标记试剂的孵育时间。

*充分洗涤（延长洗涤时间，重复次数）。

*改变检测方法。

②特异性背景：造成特异性背景问题的原因有三种因素，即污染抗体所致假阳性、交叉反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。

*如用多克隆抗体，应滴定抗体（假阳性）。

*如用多克隆抗体，亲和纯化特异性抗体（假阳性）。

*如用多克隆抗体，用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。

*换用其他抗体（交叉反应及假阳性）。