清除自由基

清除自由基

摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。

关键词：自由基医学

在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。

一、对自由基的认识

自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。

二、自由基清除剂

自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。

其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。

三、自由基清除实验

3.1 DPPH 自由基清除实验

取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。

自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。

3.2 ABTS 自由基清除实验

20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 µL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸

光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。

ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100

式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。

3.3 超氧阴离子清除实验

采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm 下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。

抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

四、清除自由基能力判断

4.1.DPPH·法测试机理

DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。

4.2. 羟基自由基（·OH）

1）邻二氮菲法

实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以 A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。

2）水杨酸法

实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的 2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。

3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系

测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH

甲基紫在酸性溶液中呈现紫色,在 578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在 578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。

4.3.超氧阴离子自由基（O2-·）

邻苯三酚法：

超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下, 邻苯三酚能