清除自由基

清除自由基
摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。

众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。

关键词：自由基医学
在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。

现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。

一、对自由基的认识
自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。

一般情况下，生命是离不开自由基活动的。

我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。

当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。

但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。

所以说自由基是一把双刃剑。

认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。

自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。

当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。

二、自由基清除剂
自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。

目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。

其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。

而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。

分光光度法最常用。

三、自由基清除实验
3.1 DPPH 自由基清除实验
取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。

同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。

4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。

自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。

3.2 ABTS 自由基清除实验
20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 µL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。

该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。

加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。

ABTS 溶液作空白吸
光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。

ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100
式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。

3.3 超氧阴离子清除实验
采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm 下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。

在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。

抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

四、清除自由基能力判断
4.1.DPPH·法测试机理
DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。

当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。

4.2. 羟基自由基（·OH）
1）邻二氮菲法
实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。

H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。

如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。

根据这一原理，可建立以 A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。

2）水杨酸法
实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的 2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。

3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系
测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH
甲基紫在酸性溶液中呈现紫色,在 578nm 处有强吸收。

反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。

通过测定甲基紫在 578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。

当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。

4.3.超氧阴离子自由基（O2-·）
邻苯三酚法：
超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下, 邻苯三酚能
发生自氧化反应,生成 O2-·和有色中间产物, 该中间产物在λ=320 nm处有一特征吸收峰。

在初始阶段, 中间产物的量与时间成线性关系。

当加入O2-·清除剂时, 它能迅速与 O2-·反应, 从而阻止中间产物的积累, 致使溶液在λ =320 nm处吸收减弱。

故可以通过测定 A320 值来评价清除剂对 O2-·的清除作用。

在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，从天然植物中寻找体内自由基消除剂也将是现代医药和保健行业的发展趋势。

国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。

在这方面的研究中，中国的科学家们已经走在世界的前列。

他们已经发现并证明了，中国一些特有的食用和药用植物中，含有大量的酚类物质，这些物质的特点是，有着很容易被自由基夺走的电子，而它们在失去电子后就会成为一种对人没有伤害的稳定物质。

人类要想从根本上避免多余自由基的侵害，还要从增强环保意识，切实改善我们的生存环境做起。

1.对·DPPH自由基的清除试验[8]-[10]
精密称取12.5mg·DPPH标准品，用无水乙醇溶解并定容至250ml。

精密量取
不同体积的样品溶液，加去氧水补足1.00ml，分别加入5.00mL·DPPH溶液（如
下表6），充分混合，静置30 min，于517 nm处测吸光度值A s，5.00mL·DPPH 溶液与1.0mL无水乙醇混合后测得的吸光度A0，5.00mL无水乙醇与1.00mL样品溶液混合后测得的吸光度A b。

每个样品平行测定3次，按下式计算清除率。

清除率(%)=[A0－(A s－A b)]/A0×100%
2.对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除试验
采用邻苯三酚自氧化法。

具体操作如表7：取4.50mL0.1mol/L的Tris-HCl
缓冲液（PH8.2）于具塞试管中，于25℃恒温20min，加入不同体积的样品溶液，
去氧水补足，再加入0.40mL50.0mmol/L邻苯三酚，混匀后于25℃恒温反应4min，
立即加入0.10mL8.0mol/LHCl终止反应。

以蒸馏水做参比，在320nm处测定吸
光度值。

每个样品平均测定3次，按下式计算清除率。

清除率（%）=[1-（A
样品-A
样品空白
）/A
空白
]×100%
式中：A
空白——加邻苯三酚但不加样品的吸光度；A
样品
——加邻苯三酚和样
品的吸光度；A
样品空白
——不加邻苯三酚只加样品的吸光度。

3.对羟基自由基(·OH)的清除试验
利用H2O2与Fe2＋反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。

具体操作如表8：在250mL具塞锥形瓶中依次移入25.00mL7.5mmol/L FeS04溶液和25.00mL4%H2O2溶液，混合均匀后加入25.00mL6mmol/L水杨酸溶液，于36～37℃恒温水浴中反应15min后于510nm 处测其吸光度，此值记为A0。

将A0值的测定体系分成6份，放入25mL具塞管中，每份5.00mL，依次加入不同体积的样品溶液，去氧水补足，于36～37℃恒温水浴中反应15min，于510nm处测其吸光度，此值记为Ax。

每个样品平行测定3次，计算清除率。

4.3结果与分析
4.3.1草莓提取物对·DPPH的清除作用
·DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基。

若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链式反应的作用。

在·DPPH的反应体系中，样品YSYZ、样品DKSZ及VC 对·DPPH的清除能力如图1所示。

可以看出，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc在
试验浓度范围对·DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着质量浓度增加，清除率也逐渐增强，并且草莓样品DKSZ对·DPPH的清除能力明显高于VC。

图1.样品YSYZ、样品DKSZ和Vc对·DPPH自由基清除作用结果
4.3.2草莓提取物对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除作用
O2·-自由基是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基。

O2·-自由基可从其生成位置扩散到较远距离，达到靶位置，具有较大的危害性。

因此，对O2·-自由基的清除，可以有效地减少氧自由基的生成量。

样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对O2·-的清除作用如图2所示。

可以看出，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc均具有一定的清除超氧阴离子自由基O2·-活性，且随着样品浓度的增加，对O2·-的清除率呈上升趋势。

当样品浓度高于100µg/ml时，样品DKSZ的清除能力明显高于VC。

图2. 样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对O2·-自由基清除作用结果
4.3.3草莓提取物对羟自由基·OH的清除作用
·OH是活性氧中最活泼的氧自由基，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。

减少此类自由基，可预防衰老、心血管疾病，并具有防癌、抗癌的作用。

样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对羟自由基·OH的清除结果见图3，样品YSYZ、样品DKSZ及Vc 均具有清除羟自由基·OH的能力，且在试验浓度范围，样品YSYZ、样品DKSZ 及Vc清除羟自由基·OH的作用都呈量效关系。

图3. 样品YSYZ、样品DKSZ及Vc对羟自由基·OH清除作用结果
4.4结论
体外试验结果表明，草莓提取物样品YSYZ、样品DKSZ具有较强的还原力，可作为氢供体，具有清除·DPPH自由基、超氧阴离子自由基（O2·-）和羟自由基（·OH）能力。

长期食用含有人工合成抗氧化剂的食品可以影响人体健康，因此植物来源的食品添加剂越来越受到青睐。

植物来源的食品添加剂，特别是天然酚类还具有一定的抗氧化等保健功能。

将具有抗氧化性质的草莓酚类物质应用于功能性食品和医药等领域前景看好。