脂肪酶

脂肪酶催化药物合成
院系：化工学院
班级： 2009级制药工程2班学号： 20009650818
姓名：李红霞
脂肪酶催化药物合成
摘要：将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分
等研究。

常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。

从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。

关键词：脂肪酶；酶催化；手性拆分；药物合成；应用
一、综述
脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。

在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。

脂肪酶结构有2个特点：(1) 脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser- W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；(2) 活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护。

脂肪酶的特性脂肪酶底物专一性酶的底物专一性取决于酶分子结构，脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成。

活性中心靠近分子疏水端。

不同来源的脂肪酶存在着结构上的差异，使得不同的来源的脂肪酶有不同的底物专一性。

1.1来源
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

1.2性质
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。

脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。

脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv 就发现了这一现象。

溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在
2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。

这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。

酯酶(E C3.1.1.1)作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸(≤C8)形成的酯。

1.3生产
脂肪酶的制备方法有提取法、化学合成法和微生物发酵法。

提取法资源有限、工艺复杂、产量低；化学合成法成本太高；微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法和化学合成法，它不受环境影响，资源丰富，产酶周期短，产物较单纯且成本低，生产上易于管理。

商品化脂肪酶主要来源于各种细菌、酵母和真菌等微生物的发酵，有些霉菌可通过固态发酵及液体深层发酵两种方法进行发酵。

通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高了脂肪酶的产量，使得许多脂肪酶实现了产业化生产，尤其是基因工程的引入，大大提高了脂肪酶的产量。

由于提取材料来源和酶含量的因素，动植物脂肪酶主要应用于科学研究。

二、脂肪酶催化药物合成
目前，临床上超过60%的常用药物为手性药物。

通常的化学工艺对手性分子的合成并不理想，存在反应路径长、重金属催化剂残留和收率低等缺点；而脂肪酶对底物具有高度的立体选择性，只需单步反应就可以高效率地制备出手性产物，这使得其在光学纯化物制备和药物手性转换中具有独特的优势。

同时，脂肪酶作为生物催化剂具有高度的区域选择性，特别适合于一般化学方法难以实现的多功能化合物的合成，能很好的避免多取代产物等副作用的产生。

脂肪酶催化反应除具有高度的立体选择性和区域选择性、副反应少等特点外，还具有催化反应条件温和、无环境污染等优越性，可以保证产物的光学纯度和收率。

脂肪酶作为生物催化剂，为化学过程提供了更为清洁和高效的途径。

2.1脂肪酶催化合成抗炎镇痛药物
非甾体类抗炎镇痛药物(Nonsteroidal antiinflam- matory drugs，NSAIDs)是一类具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿和血小板聚集作用的药物，主要用于治疗多种疾病引起的持续性发炎、疼痛和发烧。

此类药物大多因手性中心的存在而具有对映
体，比如萘普生、酮洛芬、布洛芬和氟比洛芬等。

通过利用脂肪酶在手性药物拆分中具有的优势，对合成这四种药物的工艺进行了优化，获得了较好的结果。

2.1.1脂肪酶催化合成(s)-萘普生
萘普生[(+)口一甲基一6一甲氧基一2一萘乙酸]是世界上应用最多的非甾体类抗炎镇痛药物。

临床研究表明，(s)一萘普生的生理活性是其对映体的28倍，并作为单一对映体药物用于人体。

在有机溶剂中水解(R，S)一萘普生甲酯是合成(S)一萘普生的理想途径(图1)。

用皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)在超临界二氧化碳存在下的含水缓冲溶液／异辛烷反应体系中立体选择性水解消旋萘普生甲酯。

结果发现，对映体比率随着反应时间的延长而升高，对映体选择率(E)为236，转化率(z)为41．6％，产物对映体过剩值(ee。

)为98．2％，底物对映体过剩值(ee。

)为70．0％。

在超临界二氧化碳中选择合适的反应体系和实验条件，产物对映体过剩值、对映体比率、转化率、酶活性和稳定性均能达到较好的水平。

加入氨基杯[4，6]芳烃和羧基杯[6]芳烃添加剂的包裹脂肪酶与不加添加剂的包裹脂肪酶相比具有更高的转化率和立体选择性。

因此，选择适宜的添加剂对脂肪酶的立体选择性具有重要的影响。

CALB-(S)一萘普生复合物的氢键比CALB- (R)一萘普生复合物的氢键更加稳定，此外，与普通条件下相比，在超临界条件下可在更短的反应时间里具有最小能量值，得到更高的产率。

2.1.2肪酶催化合成(s)-酮洛芬
酮洛芬(口一甲基-3-苯甲酰基一苯乙酸)的羧基口一碳是手性中心，存在(R)一和(S)一对映体。

然而，(S)一酮洛芬和(R)一酮洛芬却显示了不同的药理活性。

(S)一对映体可用于减缓炎症和减轻疼痛，而(R)一对映体活性很低，甚至在有些情况下，还有不必要的生理副作用和毒性。

最近，研究人员克隆了粘质沙雷菌ECUl010的一种脂肪酶，并在大肠杆菌中表达，这种重组脂肪酶能立体选择性水解(R，S)一酮洛芬酯合成(S)一酮洛芬(图2)，ee。

达到91．6％，E达到63，z高达48．2％。

重组脂肪酶也表现了很高的
立体选择性，这为得到具有更高活性的脂肪酶提供了另外一条途径。

将CALB于酶膜反应器中固定，与游离CALB相比，固定化CALB降低了对映分离(R，S)一酮洛芬的酶量，ee。

和E分别提高到87.8％和27。

2.1.3脂肪酶催化合成(s)-布洛芬
布洛芬[2一(4一异丁基苯基)丙酸]是常用的非甾体类抗炎镇痛药物，广泛用于治疗头痛和轻微的疼痛。

消旋布洛芬的两个对映体只有(S)一对映体具有抗炎的特性[1 0|。

有报道称(S)-布洛芬酸的镇痛作用是(R)一对映体的160多倍，(R)一布洛芬不仅没有活性并且还可能引起副作用。

为了合成光学纯的(S)一布洛芬，很多研究者对脂肪酶催化消旋布洛芬的酯交换反应进行了研究。

Wang等‘123在亲水醋酸纤维素／疏水聚四氟乙烯薄膜复合材料中设计了一种特殊的微结构作为脂肪酶的载体，手性拆分消旋布洛芬，产物对映体过剩值和对映体选择率均比自由脂肪酶催化体系显著提高，这种固定化载体改善了脂肪酶的立体选择性和稳定性。

Gotte—mukkala等[13]研究了溶剂十八烷烃的侧链甲基位置和水活度对CRL催化布洛芬酯交换的对映选择性的影响(图3)。

结果显示，CRL在40。

C下水活度为0．73的异辛烷中，催化反应达到最好的效果，起始反应速率和对映选择性均较好。

Foresti等[14]利用商业脂肪酶Novozym 435，在无其它溶剂存在条件下催化(R，S)一布洛芬和乙醇的酯交换反应，并将实验数据作为分子模型进行深入的计算分析。

在最佳反应条件下，产物对映体过剩值达到54％，布洛芬转化率达到63％。

Liu等[153在0．1 mol·L-1磷酸缓冲溶液(pH值8)中，用来自子囊菌酵母的胞外脂肪酶LIP催化水解(S)-布洛芬酯，得到了高纯度的(s)一布洛芬，ee达到98％。

2.2脂肪酶合成抗抑郁药物及其中间体
达泊西汀、氟西汀、度洛西汀和西酚普兰是治疗抑郁症的临床常用药，它们均因具有手性中心而存在（S）-对映体和（R）-对映体，进而具有不同药理和生理学活性，其结构式见图5.
用南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)拆分3一氨基一3一苯基-1-丙醇(化合物I)，得到了合成(S)一达泊西汀的重要中间体N-(0-3一丁基二甲硅烷基一3一羟基一1一
苯丙基)甲氧基乙酰胺(图6)，合成的(S)一达泊西汀有较高的产率(72％)和ee(93％)。

Chaubey等‘201研究证实固定化的节杆菌属螺菌脂肪酶(ABL)在动力学拆分氟西汀中间体时具有极好的特性。

在固定化酶催化反应中，转化率、对映体过剩值和对映选择性等均显著提高。

Kamal等[213研究了固定化洋葱假单胞杆菌脂肪酶催化r叠氮醇类乙酸盐的水解和醇解反应，动力学拆分得到的对映纯y-叠氮醇类，可以用于抗抑郁药(S)一氟西汀和(S)一度洛西汀的合成。

Wang等[22’2朝在以乙酰乙烯酯为酰基供体的无溶剂体系中，研究了固定化南极假丝酵母脂肪酶B催化拆分S-4-[(4一二甲氨基)一1一(4一氟苯)一1一羟基一卜丁基]-3一羟甲基一苯基腈(西酞普兰中间体)的动力学模型，(S)一二醇的纯度达到99．5％，产率达到86．2％(图7)。

2.3脂肪酶催化合成抗菌药物及其中间体
甲霜林IN-(2，6一二甲苯基)一N一2一(甲氧乙酰基)丙氨酸甲酯]是丙氨酰胺的一种，体内实验表明其具有很好的杀菌活性，并且没有毒副作用[2引。

然而只有(R)一甲霜林具有杀菌活性[2引。

Park等[z61用固定在丁基纤维素上的洋葱假单胞杆菌脂肪酶高效合成了杀菌剂(R)一甲霜林的重要中间体2一甲氧乙基一(R)一N一(2，6-一--甲苯基)丙氨酸[(R)一2]，获得了较高的产率(34％)和ee(96％)(图8)。

穿心莲内酯是草药穿心莲的主要活性成分，具有抗菌活性[30|，多年来被广泛用于治疗多种疾病，比如细菌和病毒感染。

Chen等口¨将洋葱伯霍尔德杆菌脂肪酶固定化后在丙酮中催化穿心莲内酯制备14一乙酰基穿心莲内酯，产率达到95％(图11)。

为在非水介质体系中脂肪酶催化穿心莲内酯获得更多的穿心莲内酯类似物提供了良好的启示。

2.4脂肪酶催化合成维生素类药物
维生素是一类具有生物活性的低分子有机物，是人体进行正常物质代谢、维持正常生理功能所必不可少的类活性药物。

如果长期缺乏某种维生素，就会引起人体生理机能障碍。

在酯交换反应中，不同的酰基供体不仅影响着反应的转化率，而且也影响到区域选择性。

Zhang等对影响反应的参数进行了研究。

结果显示，在乙腈中，醋酸乙烯酯作为酰基供体，南极假丝酵母脂肪酶B(No—vozyme 435)催化合成5一。

乙酰吡哆醇(5一AcPN)的最大转化率达到99％，区域选择性达到93％。

Bai等[43] 也对该反应的影响参数进行了研究，得到了与Zhang等类似的结果。

维生素E
经酯化修饰转化成其衍生物形态，可改善其稳定性、水溶性和表面活性等。

Torres 等首次用酶催化维生素E的酰化反应。

在2一甲基一2一丁烯(2M2B)中，分别用吸附于离子交换树脂、生物可降解聚合物聚乙交酯和聚丙烯上的南极假丝酵母脂肪酶B，催化醋酸乙烯酯与维生素E进行酯交换反应，结果显示吸附于离子交换树脂的南极假丝酵母脂肪酶(Novozym 435)催化效果最好。

三、脂肪酶法制备生物柴油
3.1 游离脂肪酶法制备生物柴油
游离脂肪酶通过催化双相体系油水界面的转酯化反应制备生物柴油。

基于油水界面活化效应的特点，脂肪酶催化制备生物柴油的反应速率较快，不受底物和产物的扩散限制，产物与副产物分离简单。

苏敏光等利用游离中性脂肪酶催化泔水油与甲醇反应制备生物柴油，通过正交实验获得最佳反应条件：油与醇的摩尔比1：3 ，油与酶的质量比 1：1，温度45℃，油与溶剂的质量比1：0.6.在
此条件下反应10h。

生物柴油收率可达89.7 ％以上。

吴良彪利用游离脂肪酶催化食用废油与甲醇反应制备生物柴油，得到最佳反应条件：温度50℃，脂肪酶
催化剂用量为原料质量的3%，甲醇与食用废油的体积比为3：1，共溶剂丁酮与甲醇的体积比为 1;6,pH= 7,反应时间4h 。

在此条件下，生物柴油收率达 7 8 ％，产品的各项指标均与 0石化柴油相接近。

游离脂肪酶在反应体系中分散不均匀
且容易聚集结块,不利于回收和重复利用；并且甲醇对脂肪酶具有失活效应，限制了脂肪酶在工业规模生物柴油生产中的应用。

通过固定化技术和全细胞催化剂的采用、甲醇流加方式的改进等手段,可改善脂肪酶的催化活性和稳定性，从而降低生产成本加快生物柴油工业化进程。

3.2固定化脂肪酶法制备生物柴油
固定化酶技术克服了游离酶的不足。

固定化细胞技术是指用物理或化学方法将游离细胞固定于限定的空间区域,并使固定后的细胞拥有良好的催化活性和
重复使用性的一种方法。

近年来在生物柴油的制备研究中固定化酶有所应用，有望成为一种新型、高效、无污染、低成本的生物柴油工业化生产方法。

Yagiz
等以人工合成水滑石为载体固定化lipomz TLIM脂肪酶，考察了温度p H、粒径、时间对固定化效率的影响,并用该固定化脂肪酶催化废油脂的转酯化反应,室温( 2 4℃) 下反应105h后转化率达92.8 ％,重复使用7次后,残余酶活为36％。

高阳等以非极性大孔树脂N KA为载体,用物理吸附法固定化Candida sp.99-125脂肪酶,该法简便易行,在低水含量的庚烷体系中进行大豆油的转酯化反应，单批转化率为97.3 ％，连续反应19个批次，转化率为70.2 ％，残余酶活为85.1%.
3.3 复合脂肪酶协同催化法制备生物柴油
复合脂肪酶协同转酯化作用可解决单一脂肪酶受酰基转移速率的影响而导致转化效率低的问题。

对复合脂肪酶与单一脂肪酶的催化效果进行比较研究，可探索出能有效提高脂肪酶转化效率的生物酶法新工艺。

周位报道，在无溶剂体系中，Novozym435脂肪酶分别与Lipozyme TLIM和Lipozyme RMIM脂肪酶以质量比7：3混合时，脂肪酸甲酯收率分别达到 94.52％和96.25％，比Novozym435脂肪酶单独使用时分别提高了9.52％和9.99 ％。

在叔丁醇体系中，当Novozym435
与Lipozyme TLIM脂肪酶分别以质量比6：4和 8：2 混合时，脂肪酸甲酯收率分别为85.06 ％和81.5％，比Novozym435脂肪酶单独使用时分别提高了9.89 ％和7.48％，优化叔丁醇体系中复合脂肪酶催化条件后，脂肪酸甲酯收率达9 2 ％。

四、前景
近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起，脂肪酶的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面也取得长足进展。

目前，脂肪酶主要用于高价值的产品和具有热敏性的底物或产品，随着人们生活水平的提高，在食品、牛奶、香水、化妆品和医药中添加天然成分的产品越来越受消费者青睐。

由天然底物生物合成的化合物被认定为天然产物，而同样的原料用化学法生产的产物则不受欢迎。

因此，天然成分在今后将会具有很大的需求，这使生物催化剂极具吸引力，所以说，脂肪酶在油脂、食品、医药、化妆品等领域具有光明的应用前景。

五、参考文献
1、张无敌，尹芳，李建昌等．生物柴油的开发利用现状分析[ J中国建设动态：阳光能源，2 0 0 6， ( 2 ) ： 5 9— 6 1 ．
2、李宇扬，孙佩慧，胡基埂等脂肪酶催化制备生物柴油的研进展[ J ] ．中国生物工程杂
志， 2 0 0 8 ， 2 8( 1 0 ) ： 1 3 6—1 4 0 ．
3、李昌珠，蒋丽娟，程树棋．生物柴油——绿色能源[ M] ．北京化学工业出版社，2 0 0
5 ． 1
6 3—1 6 4 ．
4、Tang LiangMa，Xia Liming。

Purification and partial characterization of a@asefrom
Bacillus coagulans ZJU318．Applied BiOchemisⅡy and Biotechnology2005．125(2)：139—146(SCI收录)
5、唐良华(参编)．《酶工程》(第一版)．2005．北京：科学出版社。

6、徐天闻，贾涛，许建和. 非水介质中脂肪酶催化的手性拆分研究进展[ J ] . 生物加工
过程，2 0 0 5 ，3 ( 4 ) . 1 - 8 .
7、Tang Lianghua,Xia Liming and et a1．Purification of a Lipase from
Peniciltium expansum PED一03 and Application of the Enzyme in Kinetic
Resolution of Racemic Ibuprofen： Applied Biochemistry and
Biotechnology,2007，acc印ted(SCI收录)．。