蛋白质与脂质相互作用的研究技术

●技术与方法
《生命的化学》２００６ 年 ２６ 卷 ６ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００６， ２６（６）
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和运输机体代谢所需的能量外， 脂质还作为细胞 膜的组成部分， 参与细胞表面识别和组织免疫等 生物学功能。蛋白质和脂质的相互作用异常， 往 往 会 导 致 相 关 疾 病 的 发 生［１， ２］。因 此 了 解 两 者 的 相 互作用方式、作用程度， 完善检测机制， 建立高 效准确的分析方法就显得格外重要。
收稿日期 ： ２００６－ ０８－ １７ 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目（Ｎｏ．３０４０００６５）和 山 西 省 留 学 基 金 项 目 资助 作 者 简 介 ： 王 丽 丽（１９８２—）， 女 ， 硕 士 ， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｗｌｌｗｋ＠１６３． ｃｏｍ； 肖 虹 （１９６５—） ， 女 ， 博 士 生 ， Ｅ － ｍａｉｌ： ｘｉａｏｈｈ９９＠ｙａｈｏｏ． ｃｏｍ； 石 亚 伟 （１９７１—）， 男 ， 博 士 ， 副 教 授 ， 硕 士 生 导 师 ， 联 系 作者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｙａｗｅｉｓｈｉ＠ｓｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
· ５５６ · 文章编号： １０００－ １３３６（２００６）０６－ ０５５６－ ０４
《生命的化学》２００６ 年 ２６ 卷 ６ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００６， ２６（６）
●Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ａ ｎｄ Ｍｅ ｔｈｏｄｓ
蛋白质与脂质相互作用的研究技术
王丽丽 肖 虹 石亚伟
（ 教 育 部 化 学 生 Fra Baidu bibliotek 学 重 点 实 验 室 、 山 西 大 学 生 物 技 术 研 究 所 ， 太 原 ０３０００６ ）
制细胞凋亡， 从而促进肿瘤的转移和侵袭； 另一 方面， 通过调节 Ｐ－ ｇｐ、ＭＲＰ 等多药耐药蛋白表达 使肿瘤产生多药耐药， 因此以 ＨＩＦ－ １α及其表达调 控机制作为非小细胞肺癌治疗的新的靶点， 可能 会对 ＮＳＣＬＣ 的临床治疗具有重要的意义。
参考文献
［ １ ］ Ｌｅｙｌａｎｄ－ Ｊｏｎｅｓ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００２， ２９： １４５—１５４ ［ ２ ］ Ｂｅｒｎａｒｄｓ Ｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００３， ４２５： ２４７—２４８ ［ ３ ］ Ｌｕｏ Ｆ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６， ６： ２６ ［ ４ ］ Ｊｉａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６， １６： ４０５—４１２ ［ ５ ］ Ｍａｒｘ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００４， ３０３（５６６３）： １４５４—１４５６ ［ ６ ］ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９４（６６９２）： ４８５—４９０ ［ ７ ］ Ｙｏｏｎ ＪＷ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２００２， ８： ６２—６８ ［ ８ ］ Ｊａｎｇ ＢＨ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ， ２００１， １２（７）： ３６３—３６９ ［ ９ ］ Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２００３， ３（１０）： ７２１—７３２ ［１０］ Ｔａｎｉｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２００３， ２４（１１）： １７７９—１７８３ ［１１］ 夏 曙 等． 中国肺癌杂志， ２００４， ７（４）： ３４４—３４６ ［１２］ Ｌｅｅ ＣＨ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ， ２００３， １８（２）： １９６—２０３ ［１３］ Ｗａｒｔｅｎｂｅｒｇ Ｍ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ， ２００３， １７： ５０３—５０５ ［１４］ Ｃｏｍｅｒｆｏｒｄ ＫＭ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００２， ６２： ３３８７—３３９４ ［１５］ 夏 曙 等． 中华医学杂志， ２００４， ８４（８）： ６６３—６６６ ［１６］ Ｈｉｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １９９８， ５８： ３７６１—３７６４ ［１７］ Ｈａｍｕｋ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ， ２００２， ９４： １０２３—１０３１ ［１８］ Ｃｓｉｋｉ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００６， ６６（１）： １４３—１５０ ［１９］ Ｋｉｍ ＳＪ ｅｔ ａｌ． Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， ２００５， ４９（３）： ３２５—３３５
脂质微矩阵法是从 ＰＬＯ 法衍生而来的， 为避 免纤维素薄膜对蛋白质的非特异性吸附， 将脂质 固定在生物芯片表面， 提高了检测方法的灵敏度 和可靠性。将固定了脂质的生物芯片与蛋白质一 起保温， 蛋白质因与特异脂质发生相互作用而结 合在芯片特定位置上， 通过检测系统对芯片进行 扫 描 ， 可 迅 速 得 到 所 需 信 息 。 目 前 Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏ－ ｓｃｉｅｎｃｅｓ 公 司 已 经 发 展 起 来 的 脂 质 芯 片 主 要 有 ： ＰＬ ＣｈｉｐＴＭ（磷 脂 质 芯 片 ）， ＳｐｈｉｎｇｏＣｈｉｐＴＭ（鞘 脂 质 芯 片）和 ＣａｎｎａｂｉＣｈｉｐＴＭ （类 大 麻 碱 芯 片 ）［１］。 这 类 微 型 化测定技术的最大特点就是准确有效， 可以同时 进行多个样品的检测， 样品用量小， 能特异性地 检测到野生型和突变型结合能力的差别； 其不足 之处在于， 生物体内的蛋白质和脂质的相互作用 是在特定的生理条件下发生的， 而人为地将脂质 通过共价或者非共价的方法固定在生物传感器表 面， 有可能丧失其生物学活性； 另外， 对判断结 果的计算机成像和分析系统的要求也相对较高。 该方法还在发展的初步阶段， 有待改进， 必要时 还需要与扫描电镜或质谱仪联用。 pass ３． 脂质－ 蛋白质共沉降法
素的耐药性明显增强。 ＨＩＦ－ １α可 以 与 Ｃｏｘ－ ２ 启 动 子 内 的 乏 氧 应 答
元 件 相 互 作 用 ， 从 而 使 Ｃｏｘ－ ２ 表 达 上 调 。 １９９８ 年， Ｈｉｄｅ 等［１６］ 采用免疫组织化学方法研究环加氧 酶－ ２ （ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－ ２， ＣＯＸ－ ２）在 肺 癌 中 的 表 达 并初步探讨了 ＣＯＸ－ ２ 表达与肺癌临床病理类型等 方面的关系。以后又有多项研究证实， ＣＯＸ－ ２ 在 非 小 细 胞 肺 癌 中 普 遍 表 达 上 调［１７］， ＣＯＸ－ ２ 参 与 了 多种肿瘤的细胞增殖、抗凋亡和血管生成， 与肿 瘤 的 发 生 和 发 展 密 切 相 关 。Ｃｓｉｋｉ 等 ［１８］ 的 研 究 表 明 ， 在 Ｃｏｘ－ ２ 的 启 动 子 内 含 有 能 够 与 ＨＩＦ－ １α相 互作用的乏氧应答元件， 从而在低氧条件下激活 Ｃｏｘ－ ２， 同 时 ＮＳＣＬＣ 内 过 度 表 达 的 硫 氧 还 蛋 白－ １ （ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ－ １）可 以 通 过 ＨＩＦ－ １α调 节 Ｃｏｘ－ ２ 的 转 录。有研究表 明 ， 硫 氧 还 蛋 白－ １ 和 ＨＩＦ－ １α的 过 度表达往往预示着 ＮＳＣＬＣ 的患者预后不良。非小 细胞肺癌中 ＨＩＦ－ １α与碳酸酐酶－ ＩＸ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙ－ ｄｒａｓｅ ＩＸ， ＣＡ ＩＸ）的 表 达 密 切 相 关 ， 术 后 ＮＳＣＬＣ 患 者 体 内 ＨＩＦ－ １α与 ＣＡ ＩＸ 的 表 达 量 与 其 无 瘤 生 存 率 存 在 显 著 的 统 计 学 意 义 ［１９］。
摘要： 蛋白质与脂质的相互作用是细胞内多种生命现象的基础之一， 两者相互作用的研究方法以及相互作用的 机制都是当前生物化学研究的热点之一。该文介绍两者相互作用的不同研究方法， 并比较了各种方法的优缺点 和适用范围。 关键词： 蛋白质； 脂质； 生物分子的相互作用 中 图 分 类 号 ： Ｑ７
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细胞内大分子之间的相互作用是探索生命奥 秘的重要基础。蛋白质和蛋白质、多糖以及核酸 之间的相互作用已经开展多年， 并取得了一系列 重要成果， 但是蛋白质和脂质相互作用的研究无 论在方法学、作用机制以及生物学功能等方面都 比较少。脂质作为生物分子的重要组分， 除储存
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脂质沉降方法已经被广泛用于检测脂质与蛋 白质的特异结合， 它的原理是： 将蛋白质与含不 同脂质成分和比例的脂质体温育， 然后超速离 心； 一般和脂质没有相互作用的蛋白质仍会留在 上清液中， 而与脂质有相互作用的蛋白质随脂质 体在超速离心过程中沉降下来， 将混合物的上清 液和沉淀物进行 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹检测， 通过目的蛋白质在上清液或者沉淀物中的变化， 分析目标蛋白质和脂质是否存在相互作用； 还可 以通过对脂质体中特异脂质浓度梯度实验， 确定 和目的蛋白质作用的脂的类别。Ｊｉｎ 等［５］ 运用该方 法， 比较了蛋白激酶 Ｃａ 相互作用蛋白（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ－ ｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａ ｋｉｎａｓｅ， ＰＩＣＫ１）的 不 同 区 域 与 脂 质 体 的 结 合 情 况 ， 发 现 ＢＡＲ （Ｂｉｎ／Ａｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎｓ／ Ｒｖｓ）结 构 域 和 脂 质 体 的 结 合 最 强 ， 而 处 于 其 Ｃ 端 富含酸性氨基酸区域和处于其 Ｎ 端的 ＰＤＺ（Ｐｏｓｔｓｙ－ ｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｄｉｓｋｓ ｌａｒｇｅ， Ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕ－ ｄｅｎｓ）结构域， 分别表现出对该作用的抑 制 和 促 进 两种不同的效应。脂质沉降法最大的局限性在于 对脂质物质的水溶性要求较高。 ４． 电泳迁移分析法
ＰＬＯ 主 要 用 来 检 测 与 特 定 蛋 白 质 相 互 作 用 的 脂质， 同时也可以通过纤维素薄膜上蛋白质和脂 质的作用半径分析两者的相对亲和能力。其基本 原理是： 将已知脂质梯度点在纤维素薄膜的特定 位置， 或者是相同浓度的不同脂质顺序点样在纤 维素薄膜上， 再加入被检测的蛋白质， 保温后充 分洗涤， 其中目标蛋白质与脂质发生相互作用而 结合在膜上， 在未达到饱和之前结合量呈明显梯 度， 显示不同的作用半径， 再结合免疫学方法进 行进一步检测， 可以直观地鉴定两者的相互作 用 。 Ｍｕｒｐｈｙ 等 ［３］ 用 ＰＬＯ 法 结 合 梯 度 实 验 ， 对 昆 虫杆状病毒系统重组表达的凝集素样氧化低密度 脂 蛋 白 受 体 ＬＯＸ－ １（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ／ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ－ ｅｘｐｒｅｓｓ－ ｅｄ ｌｅｃｔｉｎ－ ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ－ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）与 磷 脂 酰 胆 碱 （ＰＣ）和 磷 脂 酰 丝 氨 酸 （ＰＳ）两 种 脂 质 的 结 合 情况进行了比较， 发现它与 ＰＳ 的 相 互 作 用 明 显 ， 而 且 受 到 Ｃａ２＋的 调 节 。 该 方 法 可 以 快 速 方 便 地 检 测蛋白质与脂质的特异性相互作用， 特别是对目 的蛋白质及其突变株与脂质的相互作用可以进行 分析比较， 也可以结合免疫学方法进行直观检测； 只需要少量的目的蛋白质和脂质， 简便快捷， 所 需试剂经济易得， 专业要求不高， 在实验中广泛 应用； 有荧光标记的蛋白质还可以用荧光方法检 测。但 ＰＬＯ 仅限于定性分析蛋白质和脂质物质的 相互作用， 在定量检测方面还需要结合表面等离 子共振技术和等温滴定量热法等相关技术。 ２． 脂质微矩阵法
目前蛋白质和脂质的相互作用研究方法主要 有 ： 蛋 白 质－ 脂 质 覆 盖 法 （ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐｉｄ ｏｖｅｒｌａｙ ａｓ－ ｓａｙ， ＰＬＯ）、 脂 质 微 矩 阵 法 （ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、 脂 质－ 蛋 白 质 共 沉 降 法（ｌｉｐｉｄ－ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏ－ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、 电 泳 迁 移 分 析 法 （ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）、 等 温 滴 定 量 热 法 （ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ， ＩＴＣ）、 凝 胶 过 滤 法（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ－ ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）、表面等离子共振法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓ－ ｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ） 和 脂 质 亲 和 法（ｌｉｐｉｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ） 等［１， ３， ４］。 １． 蛋白质－ 脂质覆盖法（ＰＬＯ）
在肿瘤的形成及发展过程以及乏氧所导致的 肿瘤多药耐药机制中， ＨＩＦ－ １α起着重要的调控作 用。ＨＩＦ－ １α一方面通过与靶基因启动子序列中的 ＨＲＥ 结合调控其表达， 增加肿瘤新血管和红细胞
生成、改变能量代谢途径等， 以增加氧的利用率、 减少氧的消耗， 同时通过调控细胞周期调节蛋白 的基因和凋亡相关基因的表达改变细胞周期、抑