分子生物学实验技术课程

分子生物学实验技术讲义

1、质粒提取

质粒提取方法参考上海生工公司质粒小量提取试剂盒说明书进行，方法如下：(1) 在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基中接种目标菌株，于37℃充分震荡培养12-16h。

(2) 取1.5-5ml菌液，于室温8000g离心2min收集菌体，到净或吸干培养基。

(3) 在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吸打或震荡至彻底悬浮菌体。

(4) 加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次，室温静置2-4min。

(5) 加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10次，混匀后室温静置2min，以彻底去除RNA。

(6) 12000g离心5-10min，将上清全部小心移入吸附柱，8000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(7) 在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，8000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(8) 向吸附柱中加入500μL wash Solution，8000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(9) 重复步骤8。

(10) 将空吸附柱和收集管放入离心机，8000g离心1min。

(11) 在吸附膜中央加入50-100μL Elution Buffer，室温静置1-2min，8000g离心1min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

2、PCR扩增体系如下：

2×PCR MIX 5μl

上游引物（10μM）0.2μl

下游引物（10μM）0.2μl

质粒0.6μl

ddH2O 4μl

总体积10μl

混匀离心后，按照下列程序进行反应：

95℃5min

95℃30s

48℃30s 30cycles

72℃1min

72℃10min

10℃保存

在PCR产物中加入1μl 10×LoadingBuffer，1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。

3 、DNA纯化回收方法按照生工公司试剂盒说明书进行：

(1) 电泳介绍后在紫外线下将目的条带用锋利的小刀小心切下。

(2) 将切下的目的DNA条带放入干净的离心管中，称取重量。

(3) 向胶块中加入等体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PC溶液），50℃水浴放置10min左右，期间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（若胶块体积过大，可事先将胶块切碎）。

(4) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

(5) 向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(6) 重复步骤5。

(7) 将吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量去除漂洗液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。

(8) 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA。-20℃保存。

4、连接克隆载体

参考pMD19-T Vector说明书加入以下组分进行连接：

T载体（pMD 19-T）0.5μl

Solution Ⅰ 4.5μl

PCR产物 5.0μl

总体积10μl

混匀离心后16℃连接过夜，产物用于转化实验。

5、感受态细胞制备

(1) 从－80℃冰箱取出保存的大肠杆菌DH5a菌种，用接种针蘸取少许菌液在LB 固体平板上划线，37℃培养12－17 小时；挑取大肠杆菌单菌落，接种于2 ml LB 液体培养基中，37℃摇培过夜；

(2)按1：100的比例取500 µl菌液接种到装有50 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，37℃振荡培养2～3 小时，至OD600为0.3～0.5；

(3)在冰浴上放置10分钟，4℃下12000 g离心1分钟收集菌体，

(4)用预冷的0.1M CaCl2 500 µl悬浮菌体；12000 g，4℃离心1 分钟收集菌体，再用预冷的0.1 M CaCl2 100 µl重悬菌体，置于冰浴中备用(12～24 小时内转化效率最高)；或者加入15%～20% (v/v)甘油，200 µl每份分装，－80℃保存备用。

6、连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态DH5α，方法如下：

(1) 将连接产物加入100μL感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

(2) 42℃热击1min30s，冰上放置2min后加入LB液体培养基1ml。

(3) 37℃低速震荡培养1h。

(4) 培养结束后，将一部分菌液均匀涂于含Amp的LB培养基平板上，37℃倒置培养过夜。

7、阳性克隆的鉴定

阳性克隆采用菌落PCR进行初步筛选，然后对重组质粒进行酶切的方法进行检测。

(1) 菌落PCR检测

用灭菌的牙签蘸取单克隆划线，过夜培养后，挑取少量菌落进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 5μl

上游引物（10μM）0.2μl

下游引物（10μM）0.2μl

ddH2O 4.6μl

总体积10μl

混匀后，按照下列程序进行反应：

95℃5min

95℃30s

48℃30s 35cycles

72℃1min

72℃10min

10℃保存

将PCR产物加入1μl 10×LoadingBuffer，1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件：150V，20min。选取阳性克隆提取质粒，进行双酶切鉴定。

②质粒单酶切

酶切检测体系如下：

10×M buffer 1μl

HindⅢ质粒0.5μl 8.5μl

总体积10μl

37℃酶切3h，然后加入1μl 10×LoadingBuffer，1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件：150V，20min。