具抗氧化活性乳酸菌的筛选_张凤敏

文章编号： １００１－ ２２３０（ ２００７） ０２－ ０００４－ ０４
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
ＺＨＡＮＧ Ｆｅｎｇ－ ｍｉｎ， ＴＩＡＮ Ｆｅｎｇ－ ｗｅｉ， ＣＨＥＮ Ｗｅｉ， ＺＨＡＯ Ｊｉａｎ－ ｘｉｎ， ＺＨＡＮＧ Ｇｅｎ－ ｙｉ
２．１ 具过氧化氢耐受能力乳酸菌的筛选 当酵母菌细胞用低浓度的过氧化氢或甲萘醌处
理时， 能诱导酵母细胞产生适应能力， 以保护自身免 受更高浓度的氧化剂的危害， 这种对氧化剂耐受能力 的提高主要是因为氧化剂能够激发机体氧化防御系 统各种酶的活性的结果［１３］。因此， 本研究以耐受过氧化 氢能力作为衡量菌体抗氧化活性的一个指标， 通过在 培养有菌体的液体培养基中添加一定浓度的过氧化 氢的方法从众多菌株中筛选出耐过氧化氢能力强的 菌， 如图１所示。
待测液， 与待测液相同体积浓度为１ ｍｍｏｌ／ Ｌ的抗坏血
酸做阳性对照， 用双蒸水补齐至刻度， 在３７ ℃±０．１ ℃
的恒温水中反应１５ ｍｉｎ后 ， ６ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离 心１０ ｍｉｎ ，
然后以双蒸水作参比， 在５１０ ｎｍ下测定吸光度。清除
率为
清除率＝
Ａｉ－ Ａｘ Ａｏ
×１００％
式 中 ： Ａｏ为 对 照 液 的 吸 光 度 ； Ａｘ为 加 入 待 测 溶 液
将 离 心 所 得 的 活 细 胞 加 入 到 浓 度 为 １．０ ｍｍｏｌ／ Ｌ 的过氧化氢溶液后３７ ℃温育， 每隔半小时取样用浇注 法 于ＭＲ Ｓ固 体 培 养 基 中 培 养 ， ３７ ℃， ４８ ｈ培 养 后 计 算 活菌数［８］。并以具有高抗氧化活性的Ｌ． ｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ［４］ 和 无 抗 氧 化 活 性 菌Ｆ８作 为 对 照 。
ＵＶ２１００紫外可见分光 光 度 计 ， 高 速 冷 冻 离 心 机 ， 旋涡混合仪， ｐＨ 计 ， 生 化 培 养 箱 ， 超 声 波 破 碎 仪 ， 全 自 动灭菌锅等。 １．３ 实验方法 １．３．１ 乳酸菌的分离
从 自 然 发 酵 牛 乳 、豆 酱 、泡 菜 、生 牛 乳 等 多 种 样 品 中 取 样 ， 用 无 菌ＰＢＳ缓 冲 液 稀 释 后 ， 涂 布 于 ＭＲ Ｓ和 ＳＬ 溴甲酚绿培养基平板上， ３７ ℃厌氧培养４８ ｈ后， 挑选 典型单菌落， 划线分离纯化， 对分离所得的菌株作革 兰氏染色， 镜检， 将Ｇ＋、过氧化氢酶阴性的菌株穿刺接 种于ＣａＣＯ ３半固体ＭＲ Ｓ培养基， ４ ℃保藏备用。 １．３．２ 复筛具过氧化氢耐受能力的乳酸菌
收稿日期： ２００６－ １０－ １７ 基 金 项 目 ： 科 技 部 农 转 资 金 项 目０５ＥＦＮ２１７１００４３１， 霍 英 东 青 年 研 究 基
金９１０７２。 作者简介： 张凤敏（ １９８１－ ） ， 女， 硕士研究生， 从事乳酸菌抗氧化研究。 通讯作者： 田丰伟
４ ２００７ 年第 ３５ 卷第 ２ 期（ 总第 １９５ 期）
ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
中国乳品工业
dairyINDUSTRY
CHINA
具抗氧化活性乳酸菌的筛选
张凤敏， 田丰伟， 陈卫， 赵建新， 张根义
（江南大学 食品学院教育部食品科学与安全重点实验室， 江苏 无锡 ２１４０３６）
摘 要： 以体外过氧化氢耐受能力为指标， 从发酵食品中筛选出２株能够耐受１ ｍｍｏｌ／ Ｌ浓度过氧化氢的乳酸菌， 两株细菌的耐过氧化氢
０引言
生物氧化是生命有机体的一个重要生理过程， 通 过 生 命 氧 化 可 以 为 生 命 提 供 能 量 。但 是 在 生 命 氧 化 过 程中会产生自由基等活性分子， 作用于体内的酶、蛋 白质等生理活性物质， 从而引发多种疾病并导致衰 老 。研 究 表 明 人 类 的 一 些 疾 病 如 癌 症 、肺 气 肿 、动 脉 粥 样 硬 化 、肝 硬 化 、关 节 炎 、心 血 管 疾 病 等 都 和 体 内 氧 化 和自由基的产生有关， 尽管人的机体有抗氧化防御系 统， 但是这些系统并不能完全有效地抵御或修复氧化
将 乳 酸 菌 活 化 培 养 后 接 种 于 ＭＲ Ｓ液 体 培 养 基 中 ， ３７ ℃培 养２４ ｈ， 培 养 液 经４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ， ４ ℃离 心 １０ ｍｉｎ ， 分 离 得 到 培 养 上 清 液 备 用 ， 收 集 的 菌 体 经 去 离子水两次洗涤后， 再将菌体细胞重悬， 调整细胞浓 度为１．０×１０９ ｍＬ－ １， 所 得 菌 悬 液 分 为 两 组 ， 一 组 作 为 活 细胞组（ＩＣ）， 另一组用于细胞破碎物的制备。将乳酸菌 菌体悬液冰浴超声破碎显微镜下检查没有完整菌体 后， 以 ４ ℃， ８ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ， 收集上清液， 即 为无细胞提取物（ ＣＦＥ） ， 备用。 １．３．４ 乳酸菌对过氧化氢的耐受实验
在１００ ｍＬ灭 过 菌 的 三 角 瓶 中 加 入６０ ｍＬ的 ＭＲ Ｓ 培养基， 分别添加过氧化氢溶液， 使培养基中的起始 过 氧 化 氢 浓 度 分 别 为０．４， ０．７， １．０ ｍｍｏｌ／ Ｌ， 并 按 体 积 分 数 为１％的 接 种 量 接 入 分 离 所 得 的 菌 株 培 养 液 ， 置 于３７ ℃恒 温 培 养 箱 中 培 养 ， 每２ ｈ 取１次 菌 液 ， 用 可 见 分光光度计测其ＯＤ值， 观察每株菌在不同起始过氧 化氢浓度下的生长趋势， 筛选具有高过氧化氢耐受性 的乳酸菌。 １．３．３ 乳酸菌的培养及无细胞提取物的制备
牛乳。 （２） 主 要 试 剂 ： ＡＰＩ ５０ ＣＨ 试 剂 盒 ， ＡＰＩ ＣＨＬ培 养
基 （ 进口） ， 二苯基苦基苯肼自由基 （ＤＰＰＨ·）（ 进口） ， 过 氧 化 氢 ， ＦｅＳＯ ４， 水 杨 酸 等 及 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析纯。
（３） 培养基： 分离培养基， 改良的ＭＲ Ｓ培养基［６］， ＳＬ 溴甲酚绿培养基， 富集培养基， ＭＲ Ｓ培养基。 １．２ 主要仪器
同体积的浓度为１ ｍｍｏｌ／ Ｌ抗坏血酸相当， Ｌ１００１的羟自由基清除能力优于Ｆ１２。利用ＡＰＩ鉴定系统Ｌ１００１菌株被鉴定为植物乳杆菌Ｌａｃｔｏ－
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ１００１。
关键词： 乳酸菌； 抗氧化； 筛选； ＤＰＰＨ 自由基； 羟基自由基
中图分类号： Ｑ９３－ ３３１
文献标识码： Ａ
Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｐｅｒｓ 研究报告
１．３．５ 乳酸菌清除ＤＰＰＨ 自由基能力的测定
参 照 文 献 ［７］中 的 方 法 （ 略 有 改 进 ） ， 取 不 同 样 品
１ ｍＬ， 加入浓度为０．２ ｍｍｏｌ／ Ｌ的 ＤＰＰＨ·无水乙醇溶
液２ｍＬ， 混 匀 后 在 室 温 下 避 光 反 应３０ ｍｉｎ， 并 在 ６ ０００
后的吸光度， 每一吸光值平行测３次， 取其平均值。
１．３．７ 乳酸菌的鉴定
纯化菌株经革兰氏染色， 镜检观察细胞形态， 过
氧化氢酶反应， 采用ＡＰＩ ５０ ＣＨ 试剂盒和ＡＰＩ ＣＨＬ培
养 基 进 行４９种 碳 水 化 合 物 的 发 酵 试 验 对 分 离 乳 酸 菌
株 进 行 鉴 定［１０］。
２ 结果与讨论
１．３．６ 乳酸菌清除羟自由基（ＨＯ·）能力的测定
参照文献［９］中的方法， 在１０ ｍＬ的具塞试管中依次
加入浓度为５ ｍｍｏｌ／ Ｌ的硫酸亚铁溶液１ ｍＬ， ５ ｍｍｏｌ／ Ｌ
水 杨 酸－ 乙 醇 溶 液１ ｍＬ， ３ ｍｍｏｌ／ Ｌ 双 氧 水 溶 液１ ｍＬ
混 合 均 匀 后 加 入 不 同 体 积 （ ０．５， １．０， １．５， ２．０， ２．５ｍＬ） 的
能力与Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ的耐过氧化氢能力相当。研究了两株乳酸菌完整细胞和无细胞提取物的ＤＰＰＨ 自由基和羟自由基清除能力。结
果表明， 菌体浓度为１０９ ｍＬ－ １的Ｌ１００１完整细胞和无细胞提取物的ＤＰＰＨ 自由基清除率分别为３６．２％和３７．９％， 同样浓度的Ｆ１２完整细胞和
无细胞提取物对ＤＰＰＨ 自由基的清除率分别为２４．４％和２７．０％； 清除羟自由基实验表明， 细胞浓度为１０９ ｍＬ－ １的细胞清除羟自由基能力与
作 用 带 来 的 损 伤 ［１］。 因 此 开 发 不 同 来 源 的 抗 氧 化 剂 对 清 除 氧 自 由 基 、保 护 细 胞 和 组 织 免 受 损 伤 是 一 个 非 常 有意义的研究课题。
许多体内外实验表明： 一些乳酸菌具有显著的抗 氧化活性［２－ ５］。目前为止对乳酸菌的抗氧化机理还没有 统一的认识。据文献报道， 在乳酸菌体内有一些抗氧 化酶类物质使得其具有抗氧化活性， 如超氧化物歧化 酶、谷胱甘 肽 过 氧 化 物 酶 、 过 氧 化 氢 酶 、Ｎ ＡＤＨ 氧 化 酶、金属硫蛋白等。此外， 体内天然的抗氧化剂， 如阿 魏 酸 （ ＦＡ） 、半 胱 氨 酸 、谷 胱 甘 肽 等 也 使 乳 酸 菌 产 生 抗 氧化活性。
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｓａｆｅｔｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４０３６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｏｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ． Ｔｈｅ Ｈ２Ｏ２－ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ． Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ－ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ α， α－ ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ β－ ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ （ＤＰＰＨ） ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ－ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｉｏ ｂｙ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ ｆｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ａ Ｌ１００１ １０９ ｍＬ－ １ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ３６．２％ ａｎｄ ３７．９％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｏｆ １０９ ｍＬ－ １ Ｆ１２ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ２４．４％ ａｎｄ ２７．０％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－ ｌｙ； Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ－ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ １０９ ｍＬ－ １ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ １ｍｍｏｌ／ Ｌ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｌ１００１ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ１００１ ｂｙ ｔｈｅ ＡＰＩ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ； ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ； ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ