共聚焦显微镜使用技巧与心得
激光共聚焦显微镜操作方法-confocol
(1)用室温下的PBS洗涤细胞三次，弃去PBS；
(2)用4%的多聚甲醛溶液37o C固定细胞15-30min；
(3)用PBS洗三次，每次5min；
(4)用0.2%的TritonX-100透化细胞10min；
(5)PBS洗三次，每次5min；
(6)用含1%的二抗来源血清(消除非特异性影响)的PBS封闭1h；
(7)PBS洗三次，每次5min；
(8)室温孵育一抗1h(用封闭液配制,1:50)；(两个抗体可以一起孵育)
(9)PBS洗三次，每次5min；
(10)室温避光孵育二抗1h(用封闭液配制,1:50)；
(11)用PBS洗三次，每次5min (以下步骤均需避光进行) ；
(可省略)(12)用RNase在37o C下消化细胞30min(使用终浓度为20μg/ml)以除去细胞内的RNA；
(13)PBS洗三次，每次5min；
(14)用Hochest33342对细胞核进行染色(使用浓度为1μg/ml,1:1000),室温避光处理20min；
(15)用PBS洗三次，每次5min；
(16)置于激光共聚焦扫描显微镜下,用100×油镜进行观察,并保存结果。
蔡司共聚焦显微镜安全操作及保养规程
蔡司共聚焦显微镜安全操作及保养规程前言蔡司共聚焦显微镜是一种高分辨率成像设备，广泛应用于生命科学、物质科学等领域。
为保障设备安全、延长设备使用寿命，特制定本文档，介绍该设备的安全操作及保养规程。
安全操作规程1.在操作前，应查询设备的使用说明书，并全面了解设备的性能及操作方法。
2.在使用前，应先检查设备是否正常，确保仪器各部件安装牢固、电线不松动，各部件动作正常。
3.严禁将化学试剂或其他腐蚀性物质放入显微镜中，以免损坏设备。
4.操作中应遵循“先关灯后关机，先开机后开灯”的原则，确保设备正常开启或关闭。
5.切勿使用过大或过小的力量操作显微镜，以免影响设备寿命。
6.当设备因异常情况需要紧急停机时，应使用急停开关，切勿使用电源开关，避免损坏设备。
7.在设备开启状态下，切勿随意更换设备配件或涉及设备内部维修，如有异常情况应立即向厂商或专业技术人员求助。
保养规程1.在设备正常使用期间，应加强对设备的保养和维护，保持设备的清洁和干燥。
2.设备需要接通电源时，在保证电压稳定的情况下，应使用稳定的电源并加装过电压保护装置，避免对设备产生损害。
3.在操作前，应对设备进行彻底清洁，清洁过程中不得直接将水或清洁剂倒在设备上或对设备产生损害的部位。
4.在清洗设备时，应用干燥软布或软毛刷进行擦拭，切勿使用含有酸碱成分的清洁剂或物品，以免对设备产生腐蚀或损害设备表面。
5.在清洗设备表面时，不得将清洁剂或水进入仪器内部，以免对设备产生损害。
6.镜头是设备中最为重要的部分，应特别注意保养，如镜头脱落、变形、磨损或压伤等情况，应及时向专业技术人员进行维修和更换。
7.设备长时间不用时，应及时切断电源并将设备置于安全干燥的地方，保护好设备的各部件，避免设备长时间不用而导致的性能损害。
结语蔡司共聚焦显微镜是一种高精度设备，安装、操作及保养过程中需要严格遵守规程，避免对设备产生不必要的损害。
在设备的日常使用和保养过程中，我们应该掌握正确的操作和保养方法，保证设备在长期使用中保持良好的性能状态。
激光共聚焦显微镜要点解析(一)
激光共聚焦显微镜要点解析（一）激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
一、基本原理和功能1.1 基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
1.2 激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1）“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。
例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。
如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。
荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
激光共聚焦显微镜操作方法-confocol
(1)用室温下的PBS洗涤细胞三次，弃去 PBS;
(2)用4%的多聚甲醛溶液 37o C固定细胞15-30min ;
⑶用PBS洗三次，每次 5min；
(4)用 0.2%的 TritonX-100 透化细胞 10min ;
(5)PBS洗三次，每次 5min ;
(6)用含1%的二抗来源血清(消除非特异性影响 ^^PBS封闭1h;
(7)PBS洗三次，每次 5min ;
(8)室温孵育一抗1h(用封闭液配制，1:50);(两个抗体可以一起孵育)
(9)PBS洗三次，每次 5min ;
(10)室温避光孵育二抗 1h(用封闭液配制，1:50);
(11)用PBS洗三次，每次5min (以下步骤均需避光进行)；
(可省略)(12)用RNase在37o C下消化细胞 30min(使用终浓度为 20 口 g/ml以除去细胞内的
RNA ;
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(13)PBS洗三次，每次 5min ;
(14)用Hochest33342对细胞核进行染色(使用浓度为1科g/m1:1000),室温避光处理20min ;
(15)用PBS洗三次，每次 5min；
(16)置于激光共聚焦才3描显微镜下，用100汹由镜进彳T观察，并保存结果。
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜是一种常见且广泛应用于生物学、材料科学和其他领域的先进显微镜技术。
它通过使用一种特殊的激光光束和精确的光学系统，可以获取高分辨率和高对比度的显微图像。
共聚焦显微镜的原理是利用聚焦在样本上的激光光束与样本中的荧光信号进行交互，然后通过成像系统收集并转换这些信号为可视化的图像。
共聚焦显微镜的应用范围非常广泛。
下面，我将从多个角度讨论共聚焦显微镜在不同领域的应用。
1. 生物学中的应用：共聚焦显微镜在生物学研究中具有重要作用。
它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在细胞生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞内蛋白质、细胞器和细胞核等结构的分布和运动。
共聚焦显微镜还可以用于观察细胞分裂过程、细胞内信号传导和细胞凋亡等关键生物学过程。
2. 材料科学中的应用：在材料科学领域，共聚焦显微镜被广泛应用于材料的表征和分析。
它可以提供高分辨率的表面形貌和内部结构信息。
在材料表面缺陷分析中，共聚焦显微镜能够观察到微观缺陷的形貌和位置。
共聚焦显微镜还可用于材料的化学成分分析和荧光标记探针的检测。
3. 医学领域中的应用：在医学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的诊断和研究。
在癌症研究中，共聚焦显微镜可以观察到癌细胞的形貌和分布，从而帮助医生确定病情和制定治疗方案。
共聚焦显微镜还可以用于血液和生物标本的显微观察，以及对药物在体内的分布和代谢过程的研究。
总结回顾：共聚焦显微镜是一种在生物学、材料科学和医学领域具有广泛应用的先进显微镜技术。
它通过高分辨率和高对比度的显微图像提供了对样本的详细观察。
在生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞结构、蛋白质分布和细胞内过程。
在材料科学中，共聚焦显微镜广泛应用于材料的表征和分析。
在医学领域，共聚焦显微镜对癌症诊断和研究具有重要意义。
通过综合利用共聚焦显微镜的特点和功能，我们可以更深入地理解和研究生物、材料和医学等领域的重要问题。
观点和理解：共聚焦显微镜作为一项先进的显微镜技术，为我们提供了探索微观世界的窗口。
激光共聚焦显微镜操作保养规程
激光共聚焦显微镜操作保养规程激光共聚焦显微镜是用于细胞、组织、生物体等细微结构的观察研究的一种高端显微镜，除了具有普通显微镜的成像能力外，还可进行三维重构成像、时间序列成像等高端操作，因此，保养管理是激光共聚焦显微镜仪器的重要工作之一。
操作规程1.液体标本的操作将标本制备好后，应当避免直接用手触碰标本，操作时可以使用取样钳或移液器来移动标本，注意要避免标本在容器内的沉积，可以轻柔搅拌。
2.固体标本的操作将标本切片后，可以采用胶片、硅胶或药片等方法将标本粘贴在载玻片上进行操作。
在粘贴标本时，避免气泡和粘接处应尽量平滑。
3.镜头清洁在使用过程中，镜头表面会有灰尘、液滴等污物粘着，需要定期清洁。
为了避免镜头划伤或清洁液进入设备，应当使用无纺布、吹灰球等软性材料进行清洁。
若涉及清洁液，应使用干净柔软的棉纱涂抹。
4.光源清洁光源也可能会受到灰尘、污物污染，对成像有影响。
应注意安全，关闭激光器，使用无纺布擦拭光源，并尽量避免触摸。
5.技术操作a.试图避免将镜头对准裸露样本区，以减少激光成像对样本的损伤。
b.当进行相机观察时，试图将突出物体置于中心以便于观察。
c.操作过程中，需要注意声音的影响。
尽量削减操作中的声响，避免干扰周围环境。
d.镜头接近样本时，注意调节放大倍数，避免出现镜头意外接触样本导致设备损伤。
保养规程1.设备开放时间每台设备都有使用年限，如果超过一两年没有进行操作，建议每月至少开启一次设备电源预加热半个小时。
2.清洁检查每日清洁：应每日用适当的消毒液进行清洁，保持表面的清洁干燥。
周清洁：清除顶部悬挂的轮廓空气清洁器中悬挂的尘埃、颗粒等物质。
若是清洁时需要清除有污物的仪器表面，应将污物清洁净后，在使用设备之前将设备彻底干燥。
月保养：同时除去设备上装置的气缸、定位器、制动器等摆动部位之主要乳液残留物，即可保证设备的正常使用期上效果佳。
3.定期检查对设备进行定期检查，以便及时察觉并处理潜在问题。
若发现设备电力不稳定，不要随意拆卸设备，而应该第一时间联系指定维修人员处理。
Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用
Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用对于使用激光扫描共聚焦显微镜的研究者来说，实验设计、样品准备、仪器操作和后期图片处理是一个实验至关重要的四步，前两步是任何一个研究者都必须具备的能力，否则无从谈起上机实验，后期图片处理无非就是修饰润色使图片从视觉上更美观，而对大多数从事生物学医学领域的研究者来说，仪器的操作可能是最关键的一步，而仪器操作中光路的设置和不同扫描模式的选择可能是最难掌握和最难学习的模块，因为这部分可能涉及一些物理光谱学的知识。
文章就以自己实验室Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜为例，简要介绍其三种光路设置和五种不同扫描模式如何选择使用，希望对使用者有所帮助。
标签：激光扫描共聚焦显微镜；光路设置；扫描模式引言随着现代科学技术的飞速发展，各种荧光蛋白、荧光染料和精密光学元件不断出现[1-5]，激光扫描共聚焦显微镜技术得到了极大的发展，各种公司，各种型号的共聚焦系统不间断问世或完善，广泛应用在细胞生物学医学领域[6-8]。
广泛的应用使得这一设计精密又操作复杂的仪器必须让有需要的研究者方便学习和掌握。
就以蔡司公司为例，科学技术的发展和适应市场的需要，不同型号的共聚焦系统逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技术提高的同时，操作软件也在一步步简化。
文章以华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的一台超高灵敏度检测Zeiss LSM 780系统为例，介绍其光路设置和不同扫描模式的选择，因为它是目前蔡司公司推出的上述普通激光扫描共聚焦显微镜中型号最高的一款，它的光路设置和扫描模式的配置将集上述所有型号系统的内置设置于一身，希望能给实验者提供较全面的指导。
1 Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜三种光路设置（1）最“傻瓜式”一键操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011软件，软件操作界面有一个Resue按钮。
激光共聚焦使用技巧和注意事项
犹他大学神经生物与解剖学 美国犹他州盐湖城 样品：斑马鱼胚胎视网膜神经轴突 技术：共聚焦显微镜
吉森大学生殖生物学系解剖学与细胞生物学中心 德国吉森 样品：大鼠睾丸冰冻切片 技术：共聚焦显微镜
德国汉堡大学医学中心 德国汉堡 样品：端复胞器 技术：共聚焦显微镜
显微镜常用观察方式：
BF-明场
PH -相差
光谱拆分（Unmixing）
光谱反卷积（deconvolution）
各种荧光蛋品，普遍存在着荧光发射光谱重叠 染料串色（DAPI/FITC… ） 背景自发荧光 （组织FISH、植物标本…）
Spectral Unmixing
YOYO-1 (nuclei) 515-nm emission before unmixing Alexa488 (F-Actin) Colour merged after unmixing
分辨率∝物镜数值孔径（NA） 荧光亮度∝NA4/M2
UPLFLN40XO UAPO40XO PLAPON60XO UPLSAPO60XW UPLSAPO100XO
:NA1.30 :NA1.30 :NA1.42 :NA1.20 :NA1.40
正确使用物镜
低倍至高倍找标本、观察、扫描成像
针孔、激光强度和检测器灵敏度
针孔
一般情况Pinhole处于 Auto状态
实际使用中：
薄标本（活细胞等）：增大针孔，提供图像亮度 ，得到更好反差的图像，有效的保护标本。 厚标本（厚组织切片等）：减小针孔，获取更薄 的图像，更好细节的图像。
针孔大小关系
检测器：PMT
HV推荐值：不高于700
CTRL+H
激光等级:Class 3B
共聚焦显微镜平台安全操作及保养规程
共聚焦显微镜平台安全操作及保养规程1. 前言共聚焦显微镜（confocal microscopy）是高级显微技术的一种，可以用来观察细胞和分子级别的细节。
共聚焦显微镜平台的安全操作和保养是使用共聚焦显微镜的基本要求，可以最大程度地保护设备并确保观察结果的准确度和可靠性。
本文列出了一些共聚焦显微镜平台的安全操作和保养规程，以便用户参考并遵守。
2. 安全操作2.1 设备准备在使用共聚焦显微镜之前，需要确保设备处于正确的位置，并且连接好所有的电缆。
检查设备的耗材，例如镜片、滤光片、探头等是否已经清洗并准备好。
2.2 操作之前在操作共聚焦显微镜之前，需要知道所有操作的步骤，并了解如何使用软件进行图像采集、存储和处理。
检查所需的光源是否已经打开，并确保所有必需的设置均已经完成。
2.3 操作时在操作过程中，需要注意以下事项： - 不要在显微镜周围分散存放物品； - 在操作过程中，不要使用酒精或酚酞等溶剂，以防损坏显微镜； - 不要长时间使用显微镜，以防止灯泡过热引起损坏； - 遵循设备操作手册，防止任何操作引起机械损坏。
2.4 操作完成后在使用共聚焦显微镜完成所有操作之后，需要将设备调整到其初始位置。
彻底清洗设备，以防止污染和损坏。
关闭所有灯泡和电源，并将所有电线纠缠在一起并收拾好。
3. 保养规程3.1 每日保养在每次使用共聚焦显微镜之后，需要进行以下保养： - 清洁设备的各部分； - 更换一次使用的滤光片； - 检查设备的光源是否工作正常。
3.2 周期性保养每隔一段时间需要进行以下保养： - 清洗设备的各部分； - 更换已经磨损的设备部件； - 调整设备的各项参数。
3.3 定期保养定期保养需要进行比较复杂的修理与调整。
建议每隔6个月使用专业维修工对设备进行定期保养和检查。
4. 总结共聚焦显微镜是一种非常先进的显微技术，但是它不仅价格昂贵，而且使用起来比较复杂，因此需要注意安全操作和保养规程。
只有正确使用并保养该设备，才能确保共聚焦显微镜的寿命和性能，并获得准确的观察结果。
leica共聚焦显微镜使用说明
Leica共聚焦显微镜使用说明Step 1: 打开PC电源——“1”Step 2: 打开汞灯控制开关——“2”Step 3: 打开中控盒——“3”Step 4: 打开计算机主机——“4”，启动计算机。
注：计算机操作系统启动后方可继续开机！！Step 5: 顺序打开激光器电源Scanner—“5”，激光冷却系统LASER Ar/ArKr—“6”★注：须确认冷风开启后方可打开激光电源！！！！！Step 6: 将上图虚线框中激光功率控制旋钮——“6.5”顺时针旋转60°左右。
Step 7: 将上图所示488 nm激光管开关——“7”钥匙沿顺时针旋转约120°至显示灯亮，再将钥匙旋回竖直位置Step 8: 依次将上图所示543/594 nm激光管开关——“8”和633 nm 激光管开关——“9”钥匙沿顺时针旋转约90°至显示灯亮。
Step 9:依次打开半导体激光器电源——“10”和405 nm激光管开关——“11”，（“11”的开启方式同“8”、“9”。
）Leica共聚焦显微镜关机顺序及注意事项Step 1: 关闭软件→拷贝Data→关闭计算机Step 2: 依照开机顺序倒序关闭各个开关，由”11”→”7”, ”5”→”1”。
★注：（1）冷风——”6”不能立即关闭！！须在关闭所有硬件设备30min 后方可关闭，以使激光管完全冷却，延长使用寿命。
（2）PC电源——“1”须在电脑确定关闭后方可关闭！！数据采集Step 1: 实验前扫描样本片观察激光通路是否正常工作。
Step 2: 上样，须轻起轻落科勒照明系统，选择合适倍数物镜，通过FLUO键选择相应荧光通道，调节载物台和焦距，找到合适视野。
Step 3: 点击由Visual→Scan，点击选择扫描模式，如xy, xyz, xyt, xyzt, xyλ etc..点击选择扫描格式（一般为默认值512*512）。
Step 4: 点击打开Beam path setting窗口，对光路和检测器进行设置。
激光共聚焦显微镜使用中的常见问题及维护分析
激光共聚焦显微镜使用中的常见问题及维护分析激光扫描共聚焦显微镜从上世纪八十年代起，被广泛地应用于分子细胞生物学、生物医学、遗传学等研究领域。
但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说比较复杂，总结了操作过程中的常见问题，并提出了解决办法。
对激光扫描共聚焦显微镜这项技术的使用具有现实的参考价值。
标签：激光扫描共聚焦显微镜；荧光；图像激光扫描共聚焦显微镜与普通显微镜相比，激光共聚焦采用了能到达最高分辨率及重复性的无色差扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。
我室引进的Leica TCS SP2型激光共聚焦配有全自动DMIRBE2新型光学显微镜系统；Leica TCS SP2 AOBS扫描头；四通道荧光共焦检测器及一个投射光DIC检测器；八通道AOTF调节器；电脑主机及双屏显示器。
可进行组织和细胞的微分干涉及荧光的断层扫描；多重荧光的断层扫描及重叠；实时动态扫描及其动态构建；组织与细胞的三维动态结构构建；荧光共振能量转移的分析（FRET）；图像漂白后的荧光修复（FRAP）等。
功能强大，性能优良。
但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说有些复杂，操作过程中多会出现以下问题。
1 扫描最终图像清晰度不高造成此类问题的原因主要有两个：（1）物镜和ZOOM值选用不正确。
初学使用者大多喜欢选用10X物镜后，再将ZOOM值调到所需要的最大值。
通过ZOOM值的增大确实可以将图像放大，有助于看清图像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于物镜的倍率。
例如在10X物镜下，ZOOM值超过10就没有意义了，而且ZOOM值的增大属于电子放大，放大倍数越高，清晰度越差。
所以在所观察的样本形态体积较小的情况下，多采用高倍物镜（例如63X水镜或油镜），再适当调整ZOOM值，ZOOM 值以不超过2为佳。
（2）误将Z-Position旋转球的功能和显微镜焦距微调旋转器的功能等同。
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。
在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。
本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。
请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。
2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。
在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。
二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。
2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。
3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。
三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。
2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。
根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。
3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。
4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。
5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。
6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。
7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。
激光扫描共聚焦显微镜ZEISS780操作规程
激光扫描共聚焦显微镜ZEISS 780操作规程本设备属于精密设备，操作人员必须提前熟悉其适用范围、结构、性能及其具体操作方法，未经操作培训者不能进行上机操作。
通过操作培训的人员必须严格按照仪器管理老师的培训要求及设备使用说明书指定的操作进行工作。
1.开机提前进行镜检，确保样本无误；查看空调温度、抽湿机湿度和不间断电源工作情况。
1.1开三相稳压电源。
注意：先开稳压电源后面的黑色扳手开关①，再按下稳压电源前面的绿色按钮②，如果出现报警声，请马上关闭稳压电源，并报告管理人员。
1.2两分钟以后依次打开电源控制板上的三个开关。
先打开主开关MAIN SWITCH③，再依次打开SYSTEMS/PC④和COMPONENTS⑤开关。
注意：各个开关不要同时按下，开机时仪器会进行自检，每按下一个开关，请等待相应的部件自检完毕后再开下一个开关。
1.3打开电脑开关⑨，点击“LSM User”图标，进入桌面；当看到桌面右下角显示“注意安全”图标时，方可点击桌面中央的ZE N软件图标；然后点击“Start System”按钮开启软件。
注意：当桌面右下角始终不显示“注意安全”图标时，不可启动软件。
这时把电脑主机左边那台仪器的盖子掀开，按一下“Reset”按钮，等待电脑桌面右下角出现“注意安全”图标。
1.4打开氩离子激光器（若不使用458nm或488nm或514nm激光线则不需要打开）。
先打开氩离子激光器正面的开关ON⑥，再顺时针旋转钥匙⑦至“—”的方向，等待绿色指示灯亮起方可开启光路(大约5-10min)。
注意：Ar+激光器在启动后，需要1h左右的预热时间才能进入稳定状态。
若闲置时间1h以上，可将激光器扳钮由“laser run”位置扳至“idle power”处⑧，保护激光器，延长使用寿命。
2.找目标2.1在明场下用Transmitted light找目标，点击①、②、③、④注意：如果实验只使用空气镜，放置样品后，建议先选择低倍物镜找细胞，再换用高倍物镜微调即可。
激光共聚焦显微镜设备安全操作规定
激光共聚焦显微镜设备安全操作规定1. 前言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，广泛应用于细胞学、分子生物学、神经学等多个领域。
然而，LSCM的使用需要注意潜在的危险性，如激光辐射、样品污染、化学品污染等。
故本文为LSCM设备使用者和管理员提供操作规定，以确保安全操作和科学研究的顺利进行。
2. 设备安全2.1 设备安装及操作环境•设备应该放置在稳固、干燥、通风良好的环境下。
•应该远离有潮湿气氛或者有化学气味的区域。
•设备旁应设有紫外线消毒机、紫外线灯等，以保持操作环境的干净和卫生。
•设备应该保持水平安放，禁止晃动或者触碰任何部件以免损坏设备。
2.2 操作者安全•操作者必须在获得专业培训，并按照培训规定进行操作。
•只有经过正常的操作许可才能使用设备。
•操作者必须穿戴防护眼镜防护手套等个人防护用品。
•操作结束后必须彻底清洗试样台、针头等设备，保持设备清洁卫生。
•操作者首先需要关闭LSCM的激光打开电源，并在打开电源后等待一段时间后进行试验操作。
3. 设备使用3.1 LSCM设备的开机•操作人员需要启动激光开关,并确认放置的样品适配平台已经连接。
3.2 打开样品盖•在打开样品盖前应当确认激光是否关闭•在打开样品盖后，确保样品表面形状平整且没有杂物，再打开激光并启动相关的测试等设备3.3 操作针头•操作针头属于平衡针，请注意不要在操作时碰到LSCM的其他配件上。
•操作针头时需遵循操作规范，确保对试样及设备的损害减少至最少。
3.4 关闭设备•在使用完毕，应关闭激光及设备电源，并将样本保存好。
4. 设备维护及紧急处理4.1 设备维护•设备每日应该进行消毒处理，避免因样品等物质的污染对其他样品的影响。
•正确清洗试样台，尤其当使用化学试剂时尤应留意，以避免产生不必要的污染。
•设备需要经常进行调整以保证仪器量測的准确性。
4.2 常规维护及故障处理•操作人员需要定期清洗和检查设备，确保设备正常使用。
显微镜实验心得
通过本次实验，我深刻体会到了显微镜在科学研究和教学中的重要性，也提高了自己的实验操作能力和细致观察的能力。同时，我对生物学或材料学等领域的研究产生了更浓厚的兴趣。
六、改进建议
在实验过程中，我也发现一些可以改进的地方，比如提前准备好样本、熟悉显微镜的使用说明书等，以提高实验效率和观察效果。
三、观察样本
在观察样本时，我发现需要注重细节，比如调节焦距、光源和放大倍数，以便更清晰地观察样本的细胞结构或其他微小特征。同时，我也发现可以在观察过程中进行标记或记录，以便后续分析和报告。
四、注意事项
在实验过程中，我发现需要注意的事项包括避免触碰镜片表面、轻拿轻放显微镜等。另外，还需要及时清洁镜片和调整好样本位置，以保证观察效果。
七、总结
通过本次实验，我不仅学会了如何正确使用显微镜进行观察，还对显微镜的结构和工作原理有了更深入的了解。这对我未来的学习和科研工作都有着重要的意义。希望在以后的实验中能够运用好这些知识和经验，取得更好的实验成果。
显微镜实验心得
通过本次显微镜实验，我对显微镜的原理和使用心得体会：
一、准备工作
在进行显微镜实验前，我首先需要准备样本、玻璃片、盖玻片以及显微镜本身。确保显微镜处于水平放置，调整放大倍数为最小，准备工作做好之后，我开始了实验。
二、调节显微镜
在调节显微镜时，我发现首先需要调节光源，调暗光源并调节镜片到最佳位置，确保样本能够清晰地显示在视野中。然后，我慢慢调节放大倍数，直到样本清晰可见。
共聚焦显微拍摄的步骤及方法
共聚焦显微拍摄的步骤及方法
一、技术简介
激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%-40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光扫描共聚焦显微镜以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源，经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。
样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。
二、实验流程
1. 样品的固定（多聚甲醛固定法）。
2. 组织的冷冻包埋和切片（干冰冷冻包埋法）。
3. 免疫荧光标记。
4. 先在荧光显微镜下观察确认标记成功，然后移至共聚焦显微镜下进行观测。
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共聚焦显微镜使用技巧与心得（一）之荧光原理篇
关键词：共聚焦显微镜心得2014-12-24 09:46 来源：丁香园点击次数：1112
工欲善其事必先利其器，想用好共聚焦显微镜光会用操作可不行，那永远不可能成为“共聚焦达人”，要想成为“达人“必先懂得原理，好吧，开始啦。
什么是荧光？
荧光：
荧光现象是物质在光的照射下所产生的发光现象。
首先荧光是一种光致发光现象，荧光物质必须是在光的照射下才能发光。
否则就是其他的发光现象而不是荧光。
例如夜光物质，夜光表，虽然也需要先用光照射，但离开光照射后它还能继续发光，就不是荧光。
这叫磷光。
另外一个例子是作western blot时用化学发光，也是发光，但不是荧光。
其次，荧光物质发出的荧光与照射光的色彩不同。
准确地说，是荧光物质发光的波长与照射光的波长是不同的。
典型的荧光物质是在紫外线照射下能发出黄绿色的荧光。
例如钱上的的荧光防伪标记，用紫外线照射后能发黄绿色的光。
所以在使用荧光显微镜的照片，观察绿色荧光样品时，你会看到物镜下照射到样品的光是蓝色的光。
观察红色荧光样品时，照射样品的却是绿色的光。
但在目镜里却能分别看到绿色与红色的荧光图像。
在荧光显微镜里，使用蓝色光照射样品后，样品发出的绿色荧光与照射样品的蓝色光混在一起，经过一个滤光片，把蓝色的照射光过滤掉，这样在目镜上就只看到绿色的荧光了。
样品发出的荧光，虽然有一种颜色，但它并不是单色光，而是有一定波长分布范围的混合光。
具体测量出每个波长下的相对光强，作一条光强-波长的关系曲线，这就是荧光光谱了。
或者称之为发射光谱。
它反映了这个物质发射的荧光的色彩成分。
一般情况下，荧光物质的荧光光谱的波长范围并不会太大，所以它会形成某种明显的颜色。
例如绿色或红色或黄绿色。
通常这个波长范围是几十个纳米。
在荧光的光谱分布中，当然会有一个波长对应着最强的荧光强度，这个波长就是我们平时所说的荧光的波长，又叫最大发射光波长，通常荧光染料的参数中的荧光波长就是这个波长。
荧光物质所发出的光实际上是这个波长上下几十纳米范围之内的。
照射样品的光叫激发光。
激发光的波长必须比荧光波长短。
这是能量守恒的因素。
短波长的
光能量高，它只能激发出能量低一点的光。
所以理论上只要比荧光波长更短的光就能激发出荧光。
发红色荧光的物质，可以用紫外光，蓝光，绿光来激发它发出红色荧光。
不过，这其中也是有某个波长的光是效率最高的。
能激发出最强的荧光。
这个就是最大激发光波长。
这也是荧光染料参数中的激发光波长。
荧光染料发出荧光，其色彩与激发光基本上无关。
就是说，如果染料是发红色荧光的，你用蓝色光，紫外光，绿色光都能激发出红色荧光，也只能激发出红色荧光。
专业点的说法，就是荧光的光谱与激发光无关。
荧光光谱是样品发出的荧光在各个波长下的强度分布。
其峰值就是最大发射光波长，或者叫最大荧光波长。
各种染料的荧光光谱基本上都是这个形状，一个简单的峰，有个最大波长，宽度大致在几十个纳米。
所以荧光虽然不是纯的单色光，但也基本上是一种颜色。
相比荧光光谱，激发光谱就稍微复杂点，一般不会是一个简单的峰，有时候会有几个峰，宽度通常能从紫外到荧光的波长。
这个意义就是通常情况下，用什么光来激发是有很大宽容度的。
只要波长比荧光波长短，就能激发出荧光来。
这就是现在的显微镜，其滤光片系统与以前不同了，以前是激发滤光片与发射滤光片可以分别选择，可以用蓝光激发红光，但现在使用滤光片组，通用的是绿光激发红光，虽然能适应大多数染料，但偶尔遇到一个需要蓝光激发红光的，就没招了。
除非另花几千块买个专用滤块。
激发光谱与发射光谱基本上是分开不重迭的，所以通常会把两个光谱画在一个图片上，就成了这个样子的。
两条曲线分别对应着激发光谱与发射光谱。
当使用两种染料时，一般是分别拍摄红色与绿色荧光。
先使用红色滤块拍摄红色荧光，此时，实际上绿色荧光也会有一点的，滤光片不可能把绿色荧光完全滤掉。
拍摄绿色荧光时也一样会有一点红色荧光。
当两个染料的荧光强度差不多的时候，漏过来的一点点其他荧光对图像没啥影响。
但是，如果两种染料的荧光强度相差太大时，就有问题了。
例如红色荧光强度为1000，绿色荧光强度为1，滤光片过滤效率为1%。
当使用绿色滤光片观察时，绿色荧光强度为1，红色的强度为1000X1%=10，漏过来的红光比绿光还要强，这时候，镜下就能看到红色的荧光，这就是串色现象。
由此可见，解决串色的办法，就是在制样时把强荧光的染料浓度降一点，让两种色彩亮度平衡。
当两种染料荧光色彩很接近的时候，例如都是绿色荧光，但波长稍有重迭而不是完全重迭，理论上是可以通过拍摄两个波长下的荧光，然后通过计算把两种荧光给分开。
现在的光谱型共聚焦显微镜有这个能力。
要分别先作两个单染色的样品，分别扫描其光谱，计算出其校正的系数，然后对双染色的样品扫描两个波长下的图片，最后根据系数来对图片进行一些计算，分别得到两个分开的图片。
这个功能在实际应用中未必有效，一般来说，两个样的荧光要足够强而且强度要平衡，才能作出有效的计算。
如果荧光弱，计算误差会相当大，就得不到好的效果了。
今天了解完原理，下一期，我们将会带大家了解怎么去安装使用共聚交显微镜，敬请关注”共聚焦显微镜使用技巧与心得“。