核酸检测技术在献血者血液筛查中的初步应用

*基金项目:东莞市科技计划医疗卫生类科研项目(ZC060401)作者简介:师玲玲(1979 7 ),女,暨南大学在读博士,助理研究员,主要从事血液筛查NAT检测研究,电话:0769 ********,Em ai:l s ll elva@ 163.co m 核酸检测与献血者血液安全

核酸检测技术在献血者血液筛查中的初步应用*

师玲玲1,2 刘赴平2 王德文2 许慧芯2 朱毅瑜2 陈少彬2

(1暨南大学临床医学院,广东广州510632;2东莞市中心血站)

摘要:目的 将核酸检测(NAT)系统应用于献血者血液筛查过程。方法 采用R oche Cobas S201系统对血站常规E I A检测合格献血者的65497份标本进行H I V、HCV和HBV3项联合筛查,并对NAT筛查阳性的标本做确证试验。结果 65497份EIA检测合格标本中,NAT共检出阳性59例,阳性检出率为0 9 ;NAT筛查阳性标本经另1种核酸检测系统确证阳性率为65 38%(17/26)。结论 NAT系统应用于献血者血液筛查有助于提高血液及输血安全。

关键词:核酸检测(NAT);献血者;H I V;HBV;HCV;血液筛查;血液安全

中图分类号:R446 6 Q522+ 4 文献标识码:A 文章编号:1004 549X(2010)01 0011 03

输血相关传染病的预防和控制已成为全社会持续关注的焦点。根据我国现行的法定要求,采供血机构对献血者的病毒血清学检测模式为H Bs A g、抗 HCV、抗 H IV联合E I A检测[1],虽然这种筛查模式已极大地降低了输血传播疾病的风险,但因抗原、抗体检测属于标志物间接检测,检测 窗口期 较长,即便第3、4代E I A试剂越来越优化,最大限度缩短了 窗口期 的时间,仍存在病毒滴度、免疫沉默性感染、病毒变异以及难以最终消除 窗口期 等因素,输血相关传染病还是时有发生[2]。越来越多的学者致力于推动病毒核酸扩增技术(nucle i c ac i d a m plificati on techn i ques,NAT)在献血者血液筛查中的应用,并且已开展了多中心的相关研究,在此基础上不少发达国家已将NAT运用在献血者血液筛查中,进一步提高了血液的安全性;国内也有少数血站将NAT 初步应用于献血者筛查,一些专家还做了在我国引入NAT 技术及其成本的分析[3 5]。我们对本站近年来免疫筛查的阴性献血者血样进行了NAT检测,报告如下。

1 材料与方法

1 1 标本来源 本站2008年8月 2009年8月采集的无偿献血者全血标本经血清学EI A检测阴性标本共65497 (人)份,其中男性34626人、女性30871人,献血者年龄18 55岁,平均(25 5)岁;采血后用3支5m l EDTA抗凝真空试管(2支带分离胶,其中1支要求无酶、无热源)留样,

2 8 冰箱保存,24h内分离血浆,在48h内将不带分离胶的留样试管用于血清学筛查,带分离胶的无酶、无热源的留样试管用于NAT检测,另外1只用于标本保存。

1 2 主要仪器与试剂 NAT筛查和核酸检测确证系统都采用R oche Cobas S201全自动核酸提取、扩增检测系统:H a m il

ton star全自动混样仪、Cobas Amp ilprep核酸提取仪及Cobas T aq m en A na lyzer核酸扩增检测仪;ELECSYS2010电化学发光检测仪(瑞士R oche)F reedom evo c li n ical全自动加样仪(TECAN);BEP 酶免分析仪(DADE BEHR I NG);KU BOTA 8420低速离心机(KU B OTA);M PR 1410R冰箱(S ANYO LABCOO L)。免疫筛查试剂:HB s A g(B i om erieux,B19K F,批号20090308,珠海丽珠试剂有限公司);抗 H IV(B io m er i eux, A60BA,批号I20090609),抗 HCV(D ia So ri n S.PA, 9320140A,批号C20090303(北京万泰生物药业股份有限公司)。NAT试剂:核酸定性筛查试剂盒(Cobas T aqScreen M PX test,批号:K10805,效期:9/30/2009);确证核酸筛查试剂:全自动荧光定量检测试剂盒包括H I V 1(批号: K0971600000,效期:8/31/2009)、H C V(批号:K1018300000效期:8/31/2009),HBV(批号:K1136200000效期:9/30/ 2009)(COBA S Am pli P rep/CO B A S T aq M an)。电化学发光检测试剂:Ro che ELECSYS2010全自动免疫电化学发光分析仪配套试剂。

1 3 NAT检测标本纳入标准 采用国产及进口2种E I A检测试剂对无偿献血者血液标本做H Bs A g、抗 HCV、抗 H I V检测,对2种试剂皆无反应性的标本进行NAT检测。

1 4 NAT检测 用全自动加样仪和全自动核酸提取、扩增检测系统对标本混合(Poo li ng)和检测:每个一级混样池(poo l)包含6个纳入NAT检测的无偿献血者标本,每个标本取167m l血浆至一级混样池,全自动混样仪加样;一级混样池标本采用Cobas T aqsceenM PX T est试剂,在全自动核酸提取仪中应用MG P磁珠分离技术原理提取核酸,核酸扩增检测仪扩增检测H B V、HCV、H IV靶序列,在PDM服务器(Ro che Cobas S201系统自带的服务器)中自动判读结果,每组检测均设置质控对照(HBV/HCV/H I V 1 O/H IV 1 M/ H I V 2),每个一级混样池均含内对照(i nterna l contro,l I C);全自动核酸提取、扩增检测系统检出的阳性一级混样池拆分为6个组,组成该一级混样池的原始标本做单标本检测,

单标本检测阳性判定为NAT阳性,单标本检测阴性判定为NAT阴性。

1 5 NAT阳性标本的确证 对NAT检测出的阳性标本再以E I A试验复查血浆、以R oche另1种NAT试剂做单标本检测试验和电化学发光检测HBs A g、抗 H Bs、抗 H Bc、H Be A g、抗 HB e。

2 结果

2 1 65497份EI A筛查阴性献血者标本NAT检测 筛查出阳性标本59份(ROCHE血筛试剂是H I V、HCV和H B V3项联合检测,检测的荧光信号具有同一性,目前尚不能区分具体项目),阴性65438份,阳性检出率0 9 (59/65497)。

2 2 NAT检测阳性标本分项确证试验 因送检时间和留取标本量的因素,将Cobas S201系统检出的26份阳性标本纳入另1种核酸检测系统做确证试验进行分项鉴别:17份标本检测到H BV RNA反应性,9份标本未检测到H BV/HCV/ H I V RNA,分项鉴别试验中阳性检出率为65 38%(17/26),且阳性检出病毒类型均为H B V RNA,未检测出H C V/H I V RNA(表1)。

3 讨论

我们对E I A筛查阴性的东莞市无偿献血者的NAT检测结果有别于深圳、青岛等血站的类似报道[6,7],0 9 的阳性检出率和北京市血液中心的结果近似[8]。分析产生阳性检出率差异或近似的原因主要可能是采用的检测系统不同,本站和北京市血液中心NAT检测均采用的是Cobas S201系统[8],故得出的NAT阳性率近似。据报道,我国香港地区也采用Cobas S201系统用于血液筛查,病毒核酸阳性检出率仅为本实验和北京血液中心的1/2[9],分析原因可能为人群分布区域差异产生HBV感染发生率差异所致。Cobas S201为美国FDA批准应用于献血者的血液筛查系统,采用磁珠捕获方法提取分离靶核酸片段,并以实时荧光PCR方法检测血液标本的核酸浓度,根据产品工作原理该系统灵敏度分别为:HBV3 7I U/m,l HCV10 7I U/m,l H I V49 0I U/m l。本实验中NAT检测采用混样池检测模式,将6份常规检测阴性标本各取167m,l混合至1个待检测样本管进行检测,根据混样程序,混合检测时系统灵敏度分别为:HBV22 2I U/m,l HCV64 2I U/m,l H I V294 0I U/m l。本实验所采用系统的灵敏度较高,可以检测出较微量的HBV DNA及H C V/H I V RNA。对全自动核酸提取、扩增检测系统检出的NAT阳性标本,采用另一种核酸检测系统进一步做HBV/HCV/H I V分项鉴别试验和乙肝 两对半 检测。

我们所采用的确证核酸检测系统的检测灵敏度为:HBV 12I U/m,l HCV15I U/m,l H IV40I U/m;l剔除送检时间和留取标本量等因素,共26份NAT阳性标本纳入分项鉴别试验,阳性检出率为65 38%(17/26),阳性检出类型均为HBV RNA(表1)。分析上述结果可知,尽管确证核酸检测系统灵敏度高于Cobas S201系统混合检测,但仍有9例Cobas S201系统检出的阳性标本在确证核酸检测系统上未检出病毒RAN。Cobas S201系统检测的病毒型主要是HBV、H CV及H I V 1 O、H I V 1 M、H IV 2型,确证核酸检测系统检出的病毒型主要是HBV型、HCV和H IV 1 O型,根据2个系统各自的工作原理可知,9份确证核酸检测系统未检出、而Cobas S201检测为阳性的标本不排除属于H IV 1 M或H I V 2型的可能,后者的引物设计是针对靶序列某一特定片段的互补序列,相同的特定片段可能出现在非靶序列,导致非特异结合和扩增,故也无法排除荧光判读过程中产生的假阳性;因我们采用的是集中进行分项鉴别试验的模式,实验过程中标本保存须经过反复冻融或分装,病毒RNA对温度变化和环境中的RNA酶较敏感[10],相对比较容易降解,9份未检出病毒RNA 的标本不排除HCV/H I V RNA降解的可能。

对经分项鉴别试验确认的17份HBV RNA阳性标本的乙肝 两对半 检测显示:H Bs A g阳性未检测出,抗 HBe、HBeAg或抗 H Bc阳性10份,无任何相关抗原抗体或抗 HBs (保护性抗体)阳性7份(表1)。据报道,我国普通人群和无偿献血人群的抗 H Be、HB e A g或抗 HBc的总体阳性概率为10%左右[11],本实验用 两对半 结果论证NAT检测结果可以认为是复核性试验,无偿献血者的 两对半 阳性率略高于普通人群,或可认为是因NAT阳性标本的病毒携带风险大于NAT阴性标本。

NAT技术作为一种新型的筛查输血传播传染病因子的检测方法,自1993年起已先后被欧美、日本以及我国香港等近20个国家和地区用来做献血者血液筛查。目前,输血安全面临的主要风险之一就是被筛查病毒的 窗口期 ;研究表明,通过NAT检测,可将输血传播H BV、HCV和H I V的EI A检测 窗口期 分别缩短25、59和11d[4]。但上述国家和地区NAT血液筛查研究主要针对的是H C V/H I V,而在我国HBV呈高流行趋势,国内研究机构虽做了一些多中心的血液残余风险评估,但数据有待进一步扩大,且有关NAT筛查献血者得到的HBV结果各地也不一:深圳从1/114(5人份poo li ng,国产试剂) 1/3724[12 14],济南为1/1619(24人份poo li ng,国产试剂)[14],青岛为1/5985(8人份poo ling,国产试剂)[7],北京为1/1433(6人份poo li ng,Cobas S201)[8]。从我们对东莞市无偿献血者血液标本做的NAT 试验结果看,现行E I A筛查模式对于H B V仍具有一定的输血残风险,而对于HCV/H IV相对较安全可靠。也有研究者认为,从检测靶物质分析,E I A指向抗原/抗体,NAT指向RNA,目前还没有证据明确显示病毒感染初期病毒RNA有效增值时间与抗原/抗体出现时间之间的关系,故认为2种方法的检测结果有互补之效,而不是简单的重复[15]。本组实验数据初步表明NAT技术参与献血者血液筛查可以提高输血安全系数,但要提高科学、量化的证据有待于扩大NAT 检测标本量及其更多数据的累积。