达托霉素的HPLC的方法学研究
达托霉素菌种选育研究
达托霉素菌种选育研究达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。
它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。
本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。
通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。
稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。
标签：达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素1前言达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。
达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。
本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。
2实验方法2.1 菌种原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。
2.2 培养方法取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基（50 mL/500 mL 摇瓶）30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。
2.3 达托霉素的检测采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。
采用峰面积计算含量。
2.4 菌种诱变及筛选2.4.1 单孢子悬浮液的制备冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。
2.4.2 紫外诱变处理用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm 的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。
2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选2.4.3.1含链霉素的分离平板培养基的制备在已灭菌的分离培养基中加入一定量的链霉素溶液，摇匀，倒平板，使成含一定浓度的链霉素平板。
达托霉素在不同酸碱条件下产生的杂质及其结构研究
的检测 和分析 ，进行 了结构认 定。除Ｔ４ 个 已知杂质之外 ，获得 了一 个未报道 的杂质 ，为达托霉素氨 基酸 内酰 胺断裂后的开环
抗 生 素 ， 由１ ３ ５ ＂ 氨 基 酸 组成 ，其 中 １ ０ 个 氨 基 酸 组成
１ 个 氨 基酸肽 环 ，另有 ３ 个 氨基 酸排 列成 线状 ，这３ 个
输 、保 藏 环节 的条 件 变化 均会 导 致 杂质 的产 生 ， 影 响 产 品质 量 和 治疗 效 果 。为评 价 药 物 的 安全 性 、 杂
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ Ｄａ ｐ ｔ ｏ ｍｙｃ ｉ ｎ； Ｉ ｍｐ ｕｒ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ ； ＨＰＬＣ ａ ｎ ａ ｌ ｙｓ ｉ ｓ ； Ｍ Ｓ— ＭＳ
达 托 霉 素 是 由玫 瑰 孢 链 霉 菌产 生 的一 种 环脂 肽
起 的感 染［ １ － ２ ］ 。 达 托 霉 素 的化 学 结构 复 杂 ，其 生产 、纯 化 、运
ｖａ ｌ ｕ ｅ ｓ ． Ｉ ｎ ｔ ｈｉ ｓ ｐ ａ ｐ ｅ ￣ｉ ｍｐ ｕｒ ｉ ｔ ｙ ｐｒ ｏ ｉｌ ｆ ｅ ｏｆ ｄ ａ ｐｔ ｏ ｍｙ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎｔ ｐＨ ｖ ａ ｌ ｕｅ ｓ ｗａ ｓ ｓ ｔ ｕｄ ｉ ｅ ｄ ． Ｕｓ ｉ ｎｇ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ ｎｄ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｖｅ ＨＰＬＣ， ｉｖ ｆ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｍｐ ｒｉ ｕ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ｄａ ｐ ｔ ｏ ｍｙｃ ｉ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ｏ ｂｔ ａ ｉ ｎｅ ｄ． Ｔｈｅ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｕｒ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ｉ ｍｐ ｒｉ ｕ ｔ ｉ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｄｅ ｎ ｔ ｉ ｉｅ ｆ ｄ ｂ ｙ ＭＳ ａ ｎ ｄ
达托霉素新杂质及其来源研究
达托霉素新杂质及其来源研究夏兴;邵东;孙新强【摘要】达托霉素是一种正在临床使用的新型抗耐药菌抗生素.由于结构特点,其具有很多结构类似的杂质.在达托霉素样品中,通过HPLC分析发现了一种新的杂质,相对保留时间为0.82.经过分离纯化,获得了纯化的新杂质.UPLC-MS检测发现新杂质的分子量为1617.核磁共振分析,确定新杂质的侧链含有双键,推定新杂质为N-(3-癸烯酰基)-L-色氨酰基-D-天冬酰胺酰基-L-天冬氨酰基-L-苏氨酰基-甘氨酰基-L-鸟氨酰基-L-天冬氨酰基-D-丙氨酰基-L-天冬氨酰基-甘氨酰基-D-丝氨酰基-苏-3甲基-L-谷氨酰基-L-3-邻氨基苯甲酰基-L-丙胺酸-ε1-内脂.根据杂质的化学结构,推测该杂质可能来源于发酵过程中补加的癸酸.因此通过GC-MS分析了起始原料癸酸,发现其中含有少量癸烯酸,该结果证实了本研究的推测.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)005【总页数】6页(P574-579)【关键词】达托霉素;杂质;MS-MS分析;核磁共振【作者】夏兴;邵东;孙新强【作者单位】上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司,上海200240;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,新昌312500;浙江医药股份有限公司新昌制药厂,新昌312500【正文语种】中文【中图分类】R978.1达托霉素是一种由13个氨基酸组成的新型脂肽类抗生素，是一种钙离子依赖型的抗生素。
在钙离子存在的条件下，它将以非共价键的形式与细胞膜上达托霉素结合蛋白(DBPs)结合。
达托霉素由微生物玫瑰孢链霉菌发酵生成的，具有在体外抗绝大多数的临床革兰阳性菌的作用，包括厌氧菌、肠球菌等耐药菌，且主要用于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在医学方面具有广阔的应用前景[1-2]。
达托霉素的化学结构复杂，结构如图1所示，其生产、纯化、运输、保藏环节的条件变化均会导致杂质的产生，影响产品质量和治疗效果。
利用高速逆流色谱分离制备达托霉素
相 。使 用 前 上 、下 相 超 声３ ｍｉ 。将 粗 品溶 于 １ ｍＬ ０ ｎ ０ 上 相和 １ｍＬ ０ 下相 的混 合溶 液 中，制备 样 品溶液 。
２４ 高速 逆流 分 离过程 ．
ＨＳ ＣＣＣ系 统 以头 到 尾 方 式 进 行 ， 上 相 为 固 定 相 ，分 离温 度 为２ ￣ 多层 柱 首 先用 上 相 充 满 。然 ０Ｃ。
上 相 和 下 相 ，然 后 通 过ＨＰ Ｃ分 析 。分配 系 数 （ 为 Ｌ 上 相 与下相 达托 霉素 峰面 积 的 比值 ｆ】 １。 ０
Ｘ ａ ｎ ｌ Ｇｅ ｉ Ｌ ｏＭｉ一 ａ ｄＲ ａ ｉｕ ｉ ｇ１ ｕ ｎ ｎ ｕ ｎ ￣ ｎ Ｘｉ ， Ｍｅ ， Ｌ
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发 酵 产 物 众 多 ，整 个 工 艺 路 线 较 长 ，期 间会 使 用 大 量 的有 机 溶 ￣ ［ 】 达 托 霉 素 结 构稳 定性 较 差 【， Ｊ６ ｌ －。而 ４ ， 】 分 离 过 程 中容 易 发 生水 解 等 变 化 ，获得 高纯 度 样 品 的难度 比较 高 。 高速 逆 流 色 谱 是一 种 液 液 分配 色 谱 方 法 ， 由Ｉ ｔ ｏ 发 明 。该 技 术 已被 广泛 用 于 制 备 少 量 的 天 然产 物 ，
Ｉ ｉ ｐ ｐ ｒ ｈｇ ｐ ｅ ｏ ｎｅ－ｕｒｎ ｈｏ ｔｇａ ｈ ＨＳ Ｃ ） ｓａｐｉｄｔ ｒｐ ｒｔ ｎｏ ａ ｔｍｙ ｉ． ｎｔ ｓ ａ ｅ， ｉｈｓｅ ｄｃ ｕ ｔ ｃ ｒｅ ｔ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ（ Ｃ Ｃ ｗａ ｐ ｌ ｐ ｅ ａａｉ ｆ ｐｏ ｃｎ Ａ ｈ ｒ ｃ ｅ ｏ ｏ ｄ ｂｐ ａｉ ｓｌｅ ｔ ｙｔ ｃ ｍｐ ｓｄｏ ｈ ｌ ｃｔ ｅｎｂ ｔ ｏ一ｍｍｏ／ ｉｕ ｒａｅｉ ａｉ ４１５ ｖ ｌｍｅｒｔ ） ｓ ｉｈ ｓ ｏｖ ｎ ｓ ｍ ｏ ｏｅ ｆ ｔｙ ｅａ ——ｕａ ｌ ｃ ｓ ｅ ｅ ａ ｔ ｎ ２ ｌ ｔ ｆ ｏｏ ｃｔ ｃ Ｌｒ ｌ ｃ ｄ（：：， ｏｕ ｉ ｗａ ａｏ
顶空气相色谱法测定达托霉素中有机溶剂残留量
顶空气相色谱法测定达托霉素中有机溶剂残留量刘世娟;郝贵周;徐健【摘要】目的建立顶空气相色谱法测定达托霉素中有机溶剂乙醇、乙腈含量的方法。
方法以DB-WAX毛细管柱为分离柱,采用程序升温,检测器为FID。
结果线性关系良好,方法精密度、重复性均符合要求。
结论该方法可用于达托霉素原料中残留溶剂乙醇和乙腈的含量测定。
【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2014(033)007【总页数】3页(P389-390,410)【关键词】顶空气相色谱法;达托霉素;溶剂残留量;测定【作者】刘世娟;郝贵周;徐健【作者单位】鲁南制药集团股份有限公司,山东临沂276006【正文语种】中文【中图分类】R927.11达托霉素由Lilly公司研发，从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的一个环脂肽类抗生素。
它不仅具有新颖的化学结构，而且其作用机制特殊：达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。
达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是它在体外对已呈现甲氧西林（methicillin）、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强力活性［1］。
在生产过程中会用到乙醇和乙腈，为控制药品质量，需要对其残留溶剂进行测定和控制。
按照《中国药典》2010年版［2］中对残留溶剂的要求，乙醇含量不得过0.5%，乙腈含量不得过0.041%。
笔者在本试验中建立了顶空毛细管气相色谱法［3，4］，测定乙醇和乙腈在达托霉素中的残留量，方法灵敏、准确。
Agilent7890A型气相色谱仪，FID检测器，化学工作站和CTC Analytics型顶空进样器，DB－WAX毛细管色谱柱。
达托霉素原料（山东新时代药业有限公司，批号：120901、120902、121001）。
乙醇与乙腈为色谱纯，N，N－二甲基甲酰胺为色谱纯。
2.1 供试品溶液及对照品溶液的配制精密称取本品约0.5 g，置20 mL顶空瓶中，精密加N，N－二甲基甲酰胺5mL使溶解，密封，作为供试品溶液；分别精密称取乙醇499.9 mg、乙腈40.6 mg，置同一100 mL量瓶中，用N，N－二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
手性衍生化-HPLC法测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型
手性衍生化-HPLC法测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型刘浩;裘亚【摘要】目的应用柱前手性衍生化-HPLC技术测定达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型.方法取达托霉素溶于6mol/L盐酸溶液,经110℃水解7h,中和,在碱性条件下与Na-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺(FDAA)经微波辅助进行衍生化反应,再用非手性HPLC系统分离测定.结果各种氨基酸衍生物、FDAA以及反应副产物之间均可得到有效分离,仿制药与原研药的8种手性氨基酸的D,L-构型完全相同,也均与文献报道一致.结论该方法可应用于达托霉素中8种手性氨基酸的D,L-构型的测定.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2016(041)001【总页数】6页(P45-49,69)【关键词】D,L-构型;手性氨基酸;达托霉素;手性衍生化;HPLC【作者】刘浩;裘亚【作者单位】上海市食品药品检验所,上海201203;上海市食品药品检验所,上海201203【正文语种】中文【中图分类】O657.7;R978.1+1达托霉素是1961年自玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵液中得到的一种酸性环脂肽类化合物，2003年9月美国FDA批准注射用达托霉素上市。
达托霉素不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任何一个已上市的抗生素不同，故不易产生耐药性[1]。
达托霉素的结构较为复杂，因结构鉴定技术的限制，曾经长期无法精确推测其分子结构。
原研的美国Lilly公司曾将其结构中的D-Asn2误认为2005年美国Cubist公司经一系列实验确认后对此公开予以纠正[3]。
多肽类化合物的一级结构决定了化合物的高级结构及功能，其中特定氨基酸的D,L-构型(绝对构型)的改变可能会导致化合物在稳定性和生物活性等方面产生显著的差异[4-6]，如达托霉素的D-Asn2被替换成L-Asn2后的抗菌活性要比达托霉素低10倍以上[3]。
达托霉素新杂质及其来源研究
Key words Daptomycin; Impurity; MS-MS; NMR
达托霉素是一种由13个氨基酸组成的新型脂肽 类抗生素，是一种钙离子依赖型的抗生素。在钙离 子存在的条件下，它将以非共价键的形式与细胞膜
பைடு நூலகம்
等耐药菌，且主要用于耐药菌，如耐万古霉素的肠
球菌(VRE),耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在医学 方面具有广阔的应用前景
达托霉素新杂质及其来源研究夏兴等
.575 .
的安全性、杂质的生物学影响，必须对相关杂质的 结构进行确证。同时，在进行达托霉素申报注册时也 需要说明相关杂质的来源，因此对相关杂质的研究 十分重要。本文在研究达托霉素相关杂质过程中⑼， 发现了一个未知杂质。通过高效液相分离纯化了该杂 质，并进行UPLC-MS和NMR测定，推定了其结构。 根据其化学结构，检测了生产原料，推测了其可能的 来源。 1仪器和试剂
Abstract Daptomycin is a new antibiotic that is being used in clinic. Due to its structural characteristics, it has many impurities with similar structures. In the sample of daptomycin, a new impurity was found through HPLC analysis, with a relative retention time of 0.82. After separation and purification, a new impurity was obtained. The
一种达托霉素的提取纯化方法
2. 如权利要求1 所述的提取纯化方法，其特征是所述的：1）、富集:A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂，吸附后收集树脂，装入解吸柱中；B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸；C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液洗脱解吸柱，收集解吸液；D、解吸液纳滤浓缩；2）、粗提取：A、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性；上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水溶液阶梯梯度洗脱；纳滤浓缩；B、中性柱层析：调浓缩液pH 至中性，向浓缩液中加入1-5% 盐；上柱后用含30-45% 低分子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱，洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍；用20-30% 低分子醇水溶液洗脱，收集洗脱流分；调pH 至中性；纳滤机浓缩；3）、精制：A、中性柱层析：浓缩液中加入1~5% 盐，调整浓缩液pH 中性；上柱后用5% 低分子醇水溶液洗脱层析柱，洗脱量为柱体积的6-9 倍；用10-20% 低分子醇水溶液洗脱，洗脱量为柱体积的8-13 倍，收集洗脱流分；收集的流分调pH 至中性；用HPLC 法检测所收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，纳滤机浓缩；B、酸性柱层析：调浓缩pH 至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和挥发性酸水溶液组成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14 倍柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；4）、冻干：冷冻干燥至粉末后，在20℃ ~30℃，压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时，得成品。
3. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤1）中的大孔吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种；步骤2）的中的层析柱填料为PRP 512、C18、或C8 中的任一种，步骤3）层析柱的填料选用C18 或C8。
4. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征步骤1）中是所述的解吸剂为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种。
【CN110117310A】一种达托霉素的纯化方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910309089.2(22)申请日 2019.04.17(71)申请人 华北制药华胜有限公司地址 052160 河北省石家庄市经济技术开发区扬子路8号(72)发明人 赵辉 张志江 王杨 张义 栗婷婷 杨丰 张丽娟 谷岩翡 刘翠莉 齐立辉 王健 (74)专利代理机构 石家庄众志华清知识产权事务所(特殊普通合伙) 13123代理人 张明月(51)Int.Cl.C07K 7/08(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C07K 1/36(2006.01)(54)发明名称一种达托霉素的纯化方法(57)摘要本发明公开了一种达托霉素的纯化方法，属于药物纯化技术领域，包括如下步骤：1）溶解；2）吸附；3）解析；4）收集；5）纳滤浓缩；6）结晶；7）抽滤：8）冻干，最终得到达托霉素纯品。
本发明的纯化方法显著提高了达托霉素纯品的纯度，并且纯化周期短、溶媒使用量低；纯化过程所用大孔吸附树脂再生方法简单，纯化过程使用先进的自动化设备，降低了操作人员的人数及操作强度。
权利要求书2页 说明书8页 附图3页CN 110117310 A 2019.08.13C N 110117310A权 利 要 求 书1/2页CN 110117310 A1.一种达托霉素的纯化方法，纯化原料是由达托霉素发酵液制备得到的达托霉素钙盐粗粉，其特征在于包括如下步骤：1）溶解：将达托霉素钙盐粗粉溶于纯化水中，然后加入饱和磷酸氢二钠溶液得到溶解液；2）吸附：向溶解液中加入助滤剂后进行过滤，得到澄清的滤液，再将滤液导入压缩后的大孔吸附树脂进行富集吸附，至大孔吸附树脂吸附饱和；3）解析：先用纯水洗涤吸附饱和的大孔吸附树脂，待流出液无色时使用浓度为15～25％的乙醇溶液洗脱，至流出液无色，最后使用浓度为35～45％的乙醇溶液进行解吸；4）收集：根据HPLC图谱收集出峰口大于92％的解吸液；5）纳滤浓缩：检测收集到的解吸液，将效价大于1000 μg/mL的解吸液合并，进行超滤纳滤浓缩，得到浓缩液；6）结晶：在浓缩液中加入饱和乙酸钙溶液作为结晶溶液进行结晶，再滴加乙醇溶液并搅拌得到混合溶液；7）抽滤：将步骤6）混合溶液进行抽滤，然后用乙醇淋洗滤饼、干燥滤饼，得到达托霉素粉状物；用水溶解达托霉素粉状物，再用树脂进行脱盐得到脱盐液；8）冻干：冻干脱盐液，最终得到达托霉素纯品。
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达托霉素的HPLC的方法学研究摘要建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。
方法以达托霉素和一些杂质为对照品，采用高效液相色谱法进行测定。
色谱条件为色谱柱：Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5µm，流速：1.0ml/min，检测波长：223nm，进样量：25µl，柱温：25℃，梯度洗脱的流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调pH 至3.1，流动相B：乙腈。
结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。
[关键词] 含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性目录摘要 (3)一、仪器与药品 (5)二、方法建立与方法描述 (5)(一)、方法建立 (5)（二）、方法描述 (5)三、验证内容 (7)（一）系统适应性 (7)（二）降解实验 (8)（三）专属性 (8)（四）定量限LOQ和检测限LOD (9)（五）线性 (12)（六）相对校正因子的计算 (18)（七）精密度 (18)（八）准确度 (23)（九）溶液稳定性 (26)（十）耐用性 (28)四、结论 (29)五、典型图谱 (30)六、参考文献 (30)一、仪器与药品电子分析天平XP205 已校正高效液相色谱仪Agilent 1200 已校正磷酸二氢铵分析纯上海光铧科技有限公司20121215 乙腈色谱纯Merck UN1648 注射用水每日更新本厂自制纯化水每日更新本厂自制达托霉素对照品P1301，94.7% 本实验室内部标定水解物P1301，91.4% 本实验室内部标定β-异构体P1301，71.9% 本实验室内部标定脱水物P1301，86.6% 本实验室内部标定达托霉素样品S130301 浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述（一）、方法建立袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0μm);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。
由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测，在190nm～360nm区间进行DAD全波段扫描。
通过DAD扫描结果显示样品在223nm 附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。
由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用Phenomenex IB-SIL C84.6×250mm 5µm色谱柱。
（二）、方法描述[含量]色谱柱：Phenomenex IB-SIL C84.6×250mm 5µm流速：1.0ml/min检测波长：223nm进样量：25µl柱温：25℃进样器温度：2~8℃流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1 流动相B：乙腈流动相：梯度洗脱A(%) B(%)0 67.5 32.545 60 4050 50 5055 50 5056 67.5 32.560 67.5 32.5稀释剂：注射用水标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。
用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量：湿计含量%= ru×Cs×P×100% rs Cu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml）rs是标准溶液所对应的主峰峰面积ru为样品溶液所对应的主峰峰面积P为对照品的含量，%无水无残溶含量计算公式：干计含量%=湿计含量% 1-水分%-残溶%限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。
[有关物质]色谱条件和样品溶液同含量。
1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。
用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量：含量%= ru×Cs×P×100% rs Cu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度（mg/ml）rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值P为对照品的含量，%限度：脱水达托霉素≤1.5%，β异构体杂质≤ 0.7%，水解物≤0.4%，杂质1（RRT 约为0.79）≤ 0.2%，杂质2 （RRT约为0.92）≤ 0.2%，杂质3 （RRT约为0.94）(C9) ≤ 0.6%，杂质4（RRT约为0.96）≤ 0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11）≤ 0.7%，杂质6组（RRT约为1.20～1.25）≤0.6%单个未知杂质≤0.1%，总杂质≤5.0%三、验证内容（一）、系统适应性系统适应性溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.01mg和25.11mg，分别置于2个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，作为STD1溶液和STD2溶液。
当色谱系统平衡后，分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液，计算RSD%和回收率，结果见表1。
表1. 系统适应性结果STD1的RSD: ≤2.0%STD2回收率：98.0～102.0%序号STD1峰面积STD2峰面积1st22610.2 22805.02nd22600.9 22695.43rd22595.2 /4th22593.9 /5th22555.1 /平均值22591.1 22750.2RSD(%) 0.09 0.34回收率(%)100.30结论：STD1的RSD%为0.09%，STD2的RSD%为0.34%，回收率为100.30%，均满足认可标准，系统适应性良好。
（二）、降解实验通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD 检测器进行分析，判断方法的专属性及稳定性指示性。
表2 降解试验结果溶液名称新增杂质相对保留时间(RRT)酸解0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729碱解0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695氧化0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263光照0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.2076、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207避光0.6032、1.5221加热0.6032、0.6936、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972高湿0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1.5695、1.6207、1.6729（三）、专属性水解物单个专属性溶液：精密称取水解物P1301 5.327mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水=1：1溶解并定容至刻度。
β-异构体单个专属性溶液：精密称取β-异构体P1301 5.930mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
脱水物单个专属性溶液：精密称取脱水物P1301 5.380mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
达托霉素样品溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.78mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
混合溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.85mg于50ml容量瓶中，分别加入各单个专属性溶液5.0ml，用稀释剂溶解并定容至刻度。
分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液，考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰，相邻各组分间分离度，结果见表3。
表3 专属性理论塔板数≥2000相邻组分间分离度≥1.0水解物β-异构体达托霉素脱水物单个组分保留时间(min) 29.697 31.783 35.068 39.943混合溶液各组分保留时间29.725 31.777 34.776 40.028(min)相对保留时间(RRT) 0.85 0.91 1.0 1.15 与相邻前一个色谱峰间分离度1.08 1.52 1.83 1.11与相邻后一个色谱峰间分离度1.73 1.36 3.002.72理论塔板数29805 32487 25316 44523 结论：各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准，专属性良好。
（四）、定量限LOQ和检测限LOD1、定量限LOQ（1）、未知杂质定量限标准溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.39mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。
1.0%对照溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。
未知杂质LOQ溶液：精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。
连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-1。
表4-1 未知杂质LOQ检测结果LOQ浓度序号峰面积S/N未知杂质Conc:0.0721µg/ml 相当于主峰浓度0.0144%1st 4.50242 12.02nd 4.20262 12.53rd 4.16507 12.14th 4.38089 12.35th 4.24095 11.06th 4.34012 13.7平均值 4.30535 /RSD% 2.94 / RSD% ≤ 5.0%，信噪比S/N：10～15，LOQ ≤ 0.05%结论：未知杂质LOQ浓度为0.0721µg/ml，峰面积RSD%为2.94%，信噪比均在10～15，均满足认可标准。