开题报告

青岛农业大学

硕士研究生个人培养计划（二）

（学位论文开题报告）

题目：小鼠启动子甲基化影响外源基因转入表达的机制

学院：动物科技学院

学科专业：动物育种与繁殖

研究方向：动物生殖发育与基因工程

学号：210091001

姓名：许登高

指导教师：潘庆杰

填表日期：2011 年03 月 6 日

说明

一、开题报告在专业或学科的范围内举行，由导师组组织实施，应当有相近专业

或校外专家参加。

二、开题报告内容：

(一) 立项依据与研究内容（4000－8000字）

1．立项依据（研究意义、国内外研究现状与分析、附参考文献目录）

2．研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题

3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、试验手段、关键技术等说明）

4．研究的特色与创新之处

5．年度研究计划及预期研究结果

(二) 研究基础与工作条件

1．工作基础（与导师或本实验室相关工作基础的关系以及本人的工作进展

2．工作条件

3．个人简历及知识结构

4．科研工作经历

(三) 经费预算

三、报告内容按以上所列提纲撰写，书写字迹务必清楚。书写或打印后与本页合订，一式三份（用A4纸打印），研究生、导师和研究生处培养科各一份。

四、本报告第三学期12月份完成。

导师意见（评语）：

签名：年月日___________________________________________________________ 导师组意见：

签名：年月日

讨论意见:

（选题指导思想及难易程度，研究内容、方法可行性及修改意见。是否通过开题报告及其成绩）

参加讨论人员姓名、职称：

会议主持人签名：

年月日___________________________________________________________ 学院意见：

签名：年月日（一）立项依据与研究内容：

1、项目的立项依据

研究意义：

自通过DNA显微注射成功获得转基因小鼠以后，人们就开始利用这一新技术来改变生物体的基因组结构从而生产出转基因动物。转基因动物的诞生是遗传学发展新的里程碑，转基因动物的出现已在基因功能及表达研究、动物品种改良及新品种培育、人类疾病模型建立、器官移植材料供应、珍贵医药用蛋白生产等各方面显示出巨大的优越性和广阔的应用前景。随着动物转基因技术的发展，人们开始更多地考虑转入的外源基因的稳定遗传和高效率地表达。近年来，越来越多的研究表明，目前动物转基因技术虽能将外源基因整合进动物基因组中，但在转基因动物生产中却存在着转基因效率低、外源基因不表达等问题，在这些问题中，其中关键的一点是转入基因的沉默不表达现象。由于近几年人们注重于转基因动物的制备研究而忽视了转基因动物个体的研究，尤其是外源基因表达的分子机制方面，人们知之甚微，这就极大程度地制约了转基因动物的应用和发展。在现实方面，我们所知转基因动物的培育成本远高于转基因植物，外源基因的高转入和高表达即意味着降低成本和提高科研的产出投入比，对转基因动物发展的影响是深远的。因此本项目借助本项目组已经建立的鼠原始生殖细胞（PGC）体外分离培养和制备转基因动物的平台，利用基因甲基化技术来分析外源基因启动子的甲基化与目的基因沉默之间的关系，阐明在转基因动物体内外源基因启动子甲基化对目的基因失活的确切影响，探讨启动子甲基化影响目的基因表达的分子机制，为今后转基因动物的有关研究和应用提供理论依据，从而使转基因动物在各个领域发挥其更大的作用。

转入基因沉默现象多是由转入基因甲基化引起。在真核生物细胞内，有一套保持遗传物质稳定的系统，即甲基转移酶系统。这个系统可以给转入基因贴上标签，然后在甲基转移酶作用下发生甲基化，从而降低转入基因表达水平甚至是沉默转入基因，以避免对细胞本身造成伤害。

本实验通过细胞和个体水平，证明了外源基因的表达受到启动子甲基化的调控，并初步探讨了这一表达调控机制。本实验的这一结果有利于进一步提高外源基因的表达水平，加快乳腺生物反应器的发展和应用。

国内外研究现状及分析

自20世纪80年代动物转基因技术出现以来[1]，人们就开始对这一新生事物

产生了极大兴趣。转基因动物的制备过程中，首要的一点是外源基因的导入，迄今为止，该技术的研究已经较为深入，例如通过显微注射，脂质体转染，逆转录病毒以及精子载体等方法均获得过转基因后代[2- 4]。但是，各方法中转基因的

效率各异，其中关键的一点是外源基因的受体不同。在后来的研究中，有些学者开始试图运用胚胎干细胞（ESCs embryonic stem cells）或原始生殖细胞（PGCs primordial germ cells）做为外源基因的受体，以增加外源基因的同源重组效率[5,6]。原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）是一种来源于外胚层的具有分化潜能的生殖细胞，是与ES细胞相类似的多功能干细胞，由于PGCs相对于ES细

胞取材相对容易，因此已成为研究动物早期细胞分化的重要工具。我们曾用

12.5dpc的胎鼠生殖嵴的PGCs肾包囊下异位发育，14天后分离卵泡，并进行体外培养，结果获得成熟的卵母细胞受精后获得了世界上首批成活后代[7-9]。在其它物种上，用PGCs(原始生殖细胞)做为外源基因受体，从而制备转基因动物已

有相关报道，Sang Hyun Park等人用慢病毒载体法将GFP基因转入鸡5.5dpc的PGCs中，在体外培养后经胚胎移植获得转基因鸡，成功表达了GFP，阳性率达到了4.4%[10]。Park等人，利用相似的方法，同样也得到类似的结果[11,12]。但利用原始生殖细胞介导转基因哺乳动物还未见报道。

转基因动物生产过程中，外源基因沉默是一个经常发生的现象，多个因素都可能导致转入的基因沉默，但人们对影响转基因沉默的机制还知之甚少。在哺乳动物基因组中，除某些管家基因和组织特异性基因调控区的CpG岛，多数基因调控区的CpG位点均已甲基化。高表达的基因（如管家基因housekeeping gene）趋向于低甲基化，而低表达的基因往往是高甲基化。甲基化模式可能是新的甲基化位点的建立或者已经甲基化的这些基因序列的去甲基化。并非所有具有甲基化模式的CpG岛都位于启动子，故在哺乳动物密码子区域的甲基化不能阻止转录的延伸[13 ]。另外，虽然对于DNA甲基化控制基因知道的很少，但是，在转基因动物中，外源基因广泛的甲基化或它的启动子甲基化会导致体内的基因沉默[14-16]。因此，寻找甲基化特异的启动子，利用其低甲基化高表达的现象，可以有选择有目的地构建载体，减弱或消除转入基因受甲基化修饰而被沉默的现象。

DNA甲基化可导致基因沉默已经被实验所证明，由于宿主细胞基因组DNA

中不同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，这种破坏后的结构便诱导宿主基因组防御系统，使新整合进去的DNA序列发生不同程度的甲基化[17]。DNA甲基化都是从

启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域[18]。但也有人发现外源基因