病毒检验技术
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1．细胞形态的改变
（2）多核巨细胞
多见于有包膜的病毒，
如呼吸道合胞病毒、麻
疹病毒等，由感染细胞 融合而成多核巨细胞
第二节 病毒的分离与鉴定
1．细胞形态的改变
（3）包涵体
某些病毒感染宿主细胞后， 细胞内出现一种光学显微镜下 可见的蛋白质结构，多为圆形、 卵圆形或不定形。一般是由完 整的病毒颗粒或尚未装配的病
卵 黄 囊 绒毛尿囊膜
绒毛尿囊膜
卵白
卵黄囊接种
主要用于虫媒病毒、衣原体及立 克次体的分离和繁殖。
绒毛尿囊膜接种 常用于牛痘病毒、天花病 毒、单纯疱疹病毒的分离
第二节 病毒的分离与鉴定
3.动物接种
• 常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等 • 常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及 脑内接种等方式
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
（二）病毒数量及病毒感染性测定
1．血凝试验
病毒颗粒
红细胞 血凝现象
某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺 乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细胞后收集的病毒液作不 同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效 价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。
第三节 病毒学检测及诊断
2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技
术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。
检测抗体的类型确定患者所处感染阶段
-----急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染
-----IgG含量的测定应取病人急性期和恢复期双份血清，若
含量升高4倍以上表明感染病毒
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标
1．细胞形态的改变
2．红细胞吸附 3．细胞培养液pH值改变
（二）病毒数量及病毒感染性测定
1．血凝试验 2．中和试验 3．空斑形成试验 4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
如：流感病毒感染------鼻咽拭子 乙型脑炎病毒感染------脑脊液 轮状病毒感染------粪便 乙型肝炎病毒感染------血液
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
3.采集方法与处理 提高病毒的分离率，防止标本污染。
采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌
第一节 标本的采集、处理与运送
（1）标本制备 ①超滤法 ②超速离心法 ③接种细胞快速增殖法 ④免疫凝集法 （2）常用观察方法 ①负染色法 ②超薄切片法 ③免疫电镜法
病毒颗粒具有亮度，在周围 较暗的背景上显示亮点 过程与病理切片过程相似
免疫组织化学与电镜技术的结合
透射电子显微镜
第三节 病毒学检测及诊断
二、血清学检测及诊断
原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原 1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒 抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg
毒亚基聚集而成，称为包涵体。
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
2．红细胞吸附 有些病毒感染细胞后,细胞膜上 可镶嵌着病毒基因编码产生的 糖蛋白,其中有些能吸附特定种 类的红细胞,或将细胞培养单层 刮下后,经过适当处理,可以凝 集特定种类的红细胞,此类糖蛋 白在细胞表面形成刺突,称为血 凝素。 3．细胞培养液pH值改变 病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培 养液pH值改变。
第二节 病毒的分离与鉴定
2．中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗 体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养 后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否 中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法 3．空斑形成试验
是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附 后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单 层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一 个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色， 则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形 成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。 每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑 形成单位 (plaque forming unit, PFU)。 病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
第三节 病毒学检测及诊断
一、形态学检查及诊断
2. 电子显微镜检查：
*透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等
*扫描电子显微镜：
用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等
扫描电子显微镜
第三节 病毒学检测及诊断
H1N1流感病毒电子显微镜图片
狂犬病病毒电子显微镜图片
第三节 病毒学检测及诊断
（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）
第二节 病毒的分离与鉴定
是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生 长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落， 细胞堆积形成葡萄状
正常细胞
病变细胞
第二节 病毒的分离与鉴定
第二节 病毒的分离与鉴定
4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）
测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病 变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测 定感染性病毒颗粒的多少
第三节 病毒学检测及诊断
一、形态学检查及诊断
1. 光学显微镜检查： *直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） *包涵体 狂犬病毒感染------嗜酸性包涵体 巨细胞病毒感染---“猫头鹰眼”状的嗜酸性包涵体
15
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
一般选用9～14d的鸡胚
优点：
来源充足、 组织分化程度低、 本身很少携带病毒和细菌、 对接种病毒不产生抗体及 病毒较易增殖等 16
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
不同病毒在鸡胚的 不同部位的生长特 性差异很大
选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键
常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种
★病毒学诊断及鉴定常用方法。 ★病毒培养的基本操作。
病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送 检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等） 进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊 断、治疗和预防提供科学依据。 检验程序包括标本的采集、分离培养鉴定、快速诊断。
二、标本的运送与保存
1.标本的运送 尽快送检 冷冻、冷藏运输
防漏、专人、标记
2.标本的保存 -70℃可较长时间保存 可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防 病毒失活
第二节 病毒的分离与鉴定
不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主 要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种 法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动 物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。
第二节 病毒的分离与鉴定
一、 病毒的分离培养
组织细胞培养
原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞 羊膜腔接种 尿囊腔接种 卵黄囊接种 绒毛尿囊膜接种 是将离体活组织块或 分散的组织细胞加以 培养的技术总称，为 病毒分离鉴定中的最 常用的基本方法。
2.鸡胚培养 鸡胚培养
动物接种
第二节 病毒的分离与鉴定
3.传代细胞 传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞 称为传代细胞，它们能在体外无限期地传代。大多是肿瘤 细胞或突变的二倍体细胞。 常用的传代细胞株有Hela细胞（人宫颈癌细胞），Hep-2 （人喉上皮癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）等。
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种 培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒 力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
常用接种途径： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种
尿 囊 腔 尿囊腔接种 常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒 和新城疫病毒的适应和传代培养
羊 膜 腔 羊膜腔接种 常用于临床流感病毒初次分离
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
人工气室
气室
羊膜腔
尿囊腔
第十七章
病毒检验技术
本 章 内 容
1
第一节 标本的采集、处理与运送
第二节 病毒的分离与鉴定
2
3
第三节 病毒学检测及诊断
学习目标及重点
学习目标： 掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用技 术 熟悉病毒血清学诊断常用的方法
了解病毒感染的实验室快速诊断
学会病毒Fra Baidu bibliotek培养基本操作 本章重点：
★病毒标本采集和运送原则。
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
1. 采集时间：发病早期或急性期尽快采集。 很多急性病毒感染，症状出现前病毒已经开始释放，症状初期病 毒量即迅速达到峰值，之后平缓下降至疾病痊愈，不过也有例外。
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。 从病原体入侵部位取材 从病原体感染的靶器官取材 根据病原体的排泄途径取材 从环境中采集标本
第三节 病毒学检测及诊断
三、分子生物学检测及诊断
1.核酸分子杂交技术
2.聚合酶链反应（PCR）-----多种病毒的快速诊断 3.基因芯片技术----如检测H1N1甲型流感病毒 4.基因测序----如病毒耐药基因型的检测
第二节 病毒的分离与鉴定
能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血 凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）
第二节 病毒的分离与鉴定
血凝抑制试验
病毒颗粒 病毒抗体 红细胞
病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗 原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑 制试验。
（一）组织细胞培养
细胞培养瓶
鸡成纤维细胞
Vero细胞
Hep-2细胞
1.原代细胞 原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞的 培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培 养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时 的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然 保留二倍体数。 2.二倍体细胞 是指原代细胞在体外分裂50代以后仍能保持其二倍染色体 数目。二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培 养病毒制备疫苗等。
（2）多核巨细胞
多见于有包膜的病毒，
如呼吸道合胞病毒、麻
疹病毒等，由感染细胞 融合而成多核巨细胞
第二节 病毒的分离与鉴定
1．细胞形态的改变
（3）包涵体
某些病毒感染宿主细胞后， 细胞内出现一种光学显微镜下 可见的蛋白质结构，多为圆形、 卵圆形或不定形。一般是由完 整的病毒颗粒或尚未装配的病
卵 黄 囊 绒毛尿囊膜
绒毛尿囊膜
卵白
卵黄囊接种
主要用于虫媒病毒、衣原体及立 克次体的分离和繁殖。
绒毛尿囊膜接种 常用于牛痘病毒、天花病 毒、单纯疱疹病毒的分离
第二节 病毒的分离与鉴定
3.动物接种
• 常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等 • 常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及 脑内接种等方式
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
（二）病毒数量及病毒感染性测定
1．血凝试验
病毒颗粒
红细胞 血凝现象
某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺 乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细胞后收集的病毒液作不 同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效 价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。
第三节 病毒学检测及诊断
2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技
术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。
检测抗体的类型确定患者所处感染阶段
-----急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染
-----IgG含量的测定应取病人急性期和恢复期双份血清，若
含量升高4倍以上表明感染病毒
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标
1．细胞形态的改变
2．红细胞吸附 3．细胞培养液pH值改变
（二）病毒数量及病毒感染性测定
1．血凝试验 2．中和试验 3．空斑形成试验 4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
如：流感病毒感染------鼻咽拭子 乙型脑炎病毒感染------脑脊液 轮状病毒感染------粪便 乙型肝炎病毒感染------血液
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
3.采集方法与处理 提高病毒的分离率，防止标本污染。
采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌
第一节 标本的采集、处理与运送
（1）标本制备 ①超滤法 ②超速离心法 ③接种细胞快速增殖法 ④免疫凝集法 （2）常用观察方法 ①负染色法 ②超薄切片法 ③免疫电镜法
病毒颗粒具有亮度，在周围 较暗的背景上显示亮点 过程与病理切片过程相似
免疫组织化学与电镜技术的结合
透射电子显微镜
第三节 病毒学检测及诊断
二、血清学检测及诊断
原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原 1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒 抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg
毒亚基聚集而成，称为包涵体。
第二节 病毒的分离与鉴定
二、病毒增殖的观察
2．红细胞吸附 有些病毒感染细胞后,细胞膜上 可镶嵌着病毒基因编码产生的 糖蛋白,其中有些能吸附特定种 类的红细胞,或将细胞培养单层 刮下后,经过适当处理,可以凝 集特定种类的红细胞,此类糖蛋 白在细胞表面形成刺突,称为血 凝素。 3．细胞培养液pH值改变 病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培 养液pH值改变。
第二节 病毒的分离与鉴定
2．中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗 体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养 后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否 中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法 3．空斑形成试验
是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附 后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单 层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一 个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色， 则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形 成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。 每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑 形成单位 (plaque forming unit, PFU)。 病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
第三节 病毒学检测及诊断
一、形态学检查及诊断
2. 电子显微镜检查：
*透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等
*扫描电子显微镜：
用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等
扫描电子显微镜
第三节 病毒学检测及诊断
H1N1流感病毒电子显微镜图片
狂犬病病毒电子显微镜图片
第三节 病毒学检测及诊断
（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）
第二节 病毒的分离与鉴定
是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生 长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落， 细胞堆积形成葡萄状
正常细胞
病变细胞
第二节 病毒的分离与鉴定
第二节 病毒的分离与鉴定
4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）
测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病 变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测 定感染性病毒颗粒的多少
第三节 病毒学检测及诊断
一、形态学检查及诊断
1. 光学显微镜检查： *直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） *包涵体 狂犬病毒感染------嗜酸性包涵体 巨细胞病毒感染---“猫头鹰眼”状的嗜酸性包涵体
15
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
一般选用9～14d的鸡胚
优点：
来源充足、 组织分化程度低、 本身很少携带病毒和细菌、 对接种病毒不产生抗体及 病毒较易增殖等 16
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
不同病毒在鸡胚的 不同部位的生长特 性差异很大
选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键
常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种
★病毒学诊断及鉴定常用方法。 ★病毒培养的基本操作。
病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送 检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等） 进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊 断、治疗和预防提供科学依据。 检验程序包括标本的采集、分离培养鉴定、快速诊断。
二、标本的运送与保存
1.标本的运送 尽快送检 冷冻、冷藏运输
防漏、专人、标记
2.标本的保存 -70℃可较长时间保存 可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防 病毒失活
第二节 病毒的分离与鉴定
不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主 要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种 法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动 物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。
第二节 病毒的分离与鉴定
一、 病毒的分离培养
组织细胞培养
原代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞 羊膜腔接种 尿囊腔接种 卵黄囊接种 绒毛尿囊膜接种 是将离体活组织块或 分散的组织细胞加以 培养的技术总称，为 病毒分离鉴定中的最 常用的基本方法。
2.鸡胚培养 鸡胚培养
动物接种
第二节 病毒的分离与鉴定
3.传代细胞 传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞 称为传代细胞，它们能在体外无限期地传代。大多是肿瘤 细胞或突变的二倍体细胞。 常用的传代细胞株有Hela细胞（人宫颈癌细胞），Hep-2 （人喉上皮癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）等。
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种 培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒 力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
常用接种途径： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种
尿 囊 腔 尿囊腔接种 常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒 和新城疫病毒的适应和传代培养
羊 膜 腔 羊膜腔接种 常用于临床流感病毒初次分离
第二节 病毒的分离与鉴定
2.鸡胚培养
人工气室
气室
羊膜腔
尿囊腔
第十七章
病毒检验技术
本 章 内 容
1
第一节 标本的采集、处理与运送
第二节 病毒的分离与鉴定
2
3
第三节 病毒学检测及诊断
学习目标及重点
学习目标： 掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用技 术 熟悉病毒血清学诊断常用的方法
了解病毒感染的实验室快速诊断
学会病毒Fra Baidu bibliotek培养基本操作 本章重点：
★病毒标本采集和运送原则。
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
1. 采集时间：发病早期或急性期尽快采集。 很多急性病毒感染，症状出现前病毒已经开始释放，症状初期病 毒量即迅速达到峰值，之后平缓下降至疾病痊愈，不过也有例外。
第一节 标本的采集、处理与运送
一、标本的采集与处理
2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。 从病原体入侵部位取材 从病原体感染的靶器官取材 根据病原体的排泄途径取材 从环境中采集标本
第三节 病毒学检测及诊断
三、分子生物学检测及诊断
1.核酸分子杂交技术
2.聚合酶链反应（PCR）-----多种病毒的快速诊断 3.基因芯片技术----如检测H1N1甲型流感病毒 4.基因测序----如病毒耐药基因型的检测
第二节 病毒的分离与鉴定
能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血 凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）
第二节 病毒的分离与鉴定
血凝抑制试验
病毒颗粒 病毒抗体 红细胞
病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗 原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑 制试验。
（一）组织细胞培养
细胞培养瓶
鸡成纤维细胞
Vero细胞
Hep-2细胞
1.原代细胞 原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞的 培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培 养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时 的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然 保留二倍体数。 2.二倍体细胞 是指原代细胞在体外分裂50代以后仍能保持其二倍染色体 数目。二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培 养病毒制备疫苗等。