高效液相色谱分析方法的建立

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激发态
S1 振动能(2)
基态
激发 ( 1)
S0
发射 ( 3)
荧光检测器原理
荧光检测器的应用
环境中的污染物 多环芳烃(PAH),多 酚,氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素;例 如:黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基 酸 生物技术及制药
多环芳烃(PAH)
O O
O
O O CH3 O
黄曲霉毒素
H3C CH3 CH3 CH3
除去杂质,纯化样品,防止色谱柱的堵塞。如生物样 品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。 富集浓缩样品或进行衍生化,以达到色谱分析的检测 限。
进行样品预处理的必要性
样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。 虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力,但样 品如果过于复杂(如中药饮片、中成药、生物样品分 析等),若不进行必要的预处理,则会影响到分析的 准确性,并且可能导致测定失败。
tR1 tR2 分离度的公式:
R
t R 2 t R1 1 ( W 2 W1 ) 2
R:分离程度的量度 简称分离度
影响分离度的因素:k、α及n
分离度方程:
k 2 1 n R k 1 4 2
是容量因子,表达了被分离组分与柱填料之 间作用的强弱
理论塔板数计算公式:
tR n 16 W
2
tR n 5.54 W h/2
2
理论塔板数n :描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。 塔板数越大,柱效越高。
tR = 5
W = .5
W=2
2
t n 16 R W 5 n 16 .5 n 1600
样品情况的了解:
测定成分的数量以及性质相似程度:
单一成分的测定,最简单,随着测定成分的增 加,分析的难度增加;
组分性质的相似程度越高,分析的难度越高。
问题:组分性质的相差越大,分析的难度越低,是否 越有利于多组分分析?
查阅有关的文献资料
文献资料——有:
在文献的基础上,调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。
选择液相色谱的检测器要考虑的因素:
你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等
流动相的影响
溶剂、缓冲盐、改性剂等 梯度还是等度(梯度不适于整体性质检测器) 准确度要求 灵敏度需求 是否有双检测的需求
HPLC检测器的选择:
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 RI mg 104 是 是 否 UV/Vis ng 105 否 否 否 ELSD ng 否 否 是 是 FL pg 103 否 否 否 MS pg 103 是 是 是 EC fg 106 是 是 是 MS pg 103 是 是 是
一般来说灵敏度还可以
0.15
Parabens at 254 nm
0.10 AU 0.05 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Minutes 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
对羟基苯甲酸酯类色谱图
UV/Vis的 缺点
由于不是所有化合物都有紫外可见吸收,因此不 是通用检测器(有时也是优点) 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时,需要 使用多波长检测,或使用折衷的波长 受流动相组成的影响: 用截止波长以上至少5~10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂(抑制拖尾) 也会有影响
2、样品情况 样品的复杂情况:HPLC适用于复杂样品的分析, 如中药分析、环境分析、体内药
物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解:
样品的种类(来源):植物(中草药)、合成中 间体、生物样品(血液、尿液、组织匀浆等) …… 样品的种类决定了样品的复杂程度(基质影响) ,从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方 法的确立设计一个大致的方向。
长时间操作的稳定性
低死体积
非破坏性
选择性(可降低分析组分色谱分离的压力)
检测器的灵敏度:信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音 的比值(S/N)
6:1
检测限(LOD):S/N = 3 定量限(LOQ):S/N = 10 高的信噪比有利于: 更好的色谱峰确认 更准确的定量 更好地完成色谱峰纯度的确认 (较低的阈值)
文献资料查询——无
根据评价液相色谱方法的标准,结合样品的情 况,作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的, 建立样品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来,制成便于 分析测定的稳定液体试样。如:中草药或中成药有效 (指标)成分分析;体液中药物或代谢物含量的测定 等。
任何先进的色谱技术都须有先进的样品处理技术相匹 配,样品处理技术的适当与否,直接关系到色谱分析 的成本、速度和实用性。
样品预处理的种类
物理的分离与浓缩技术 过滤、沉淀分离、吸附、蒸馏、溶剂的挥发 溶剂萃取 回流、索氏提取、超声波提取
固相萃取(SPE)
吸附剂(硅胶、氧化铝)、高分子大孔树脂( 苯乙烯-二乙烯苯)、离子交换树脂、 键合硅胶等 超临界流体萃取 化学衍生化技术
蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等
色谱
是一种高效能 的分离方法
色谱分析
以一定的科学理论为基础,在高效能的分离基 础上,结合先进的检测方法而建立的现代分析 方法。
什么是高效液相色谱法?
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法,简称:HPLC 是一种区别于经典液相色谱,基于现代仪器方法 的高效能分析方法: 高性能的色谱柱,高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器…… 广泛应用于各个领域: 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平, 并高速发展。
不同种类的检测器的分类
紫外/可见光检测器 荧光检测器 固定波长 可变波长 电化学检测器 光电二极管矩阵
溶质性质
放射化学检测器
氮/硫检测器
质谱检测器
示差折光检测器
整体性质
蒸发光散射检测器
电导检测器
理想的HPLC检测器
高灵敏度;可忽略基线噪音(信噪比高) 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对流动相的压力、温度及流速等变化不敏感
1. 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法的建立 2. 液相色谱常见问题及处理方法 3. 色谱联用技术(LC-MS )
4. 制备液相色谱技术
反相高效液相色谱(RP-HPLC) 分析方法的建立
什么是色谱?
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离方 法(工具、手段)。
除色谱之外,经典(常见)的分离方法:
二、选择检测器、确定使用条件
HPLC检测器应提供的功能
对样品有响应,并有一个输出信号 检测器响应值与样品浓度之间在一定的浓度范围 内呈线性关系
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液 相色谱分离! HPLC检测器可以分为:
溶质性质检测器(Solute property detectors)
对溶质的物理或化学性质响应,一般不反映流 动相的变化(选择型) 整体性质检测器(Bulk property detectors) 不管是否有溶质,对流动相任何物理性质的变 化作出响应(通用型)
tR n 16 W 5 n 16 2 n 100
2
2
2
tR与W 是一对矛盾,tR/W 可以很好地表达 这对矛盾的情况。
影响柱效的因素很多,可以从色谱理 论进行分析,如塔板理论、速率理论等, 具体内容参见有关教科书或专著。
评价液相色谱方法的标准
什么是色谱的分离度
滴定分析(原料药、制剂定量分析)
紫外可见光度分析(原料药、制剂定量分析)
薄层色谱(鉴别、有关物质检查等;半定量分析)
HPLC(中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的 检查;复杂样品定量分析等)
什么情况下使用HPLC?
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求:准确定量(RSD<5%)
测定速度和效率:快速,单一或多组分测定。
查阅有关的文献资料
文献资料——无:
结合样品的情况,首先应作一些试探性的工 作。 (见后面)
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好,没有最好!
问题:什么样的分离结果是好的? 答:用尽可能少的时间和消耗(人力、物力、财 力等)满足分析的要求(准确度、灵敏度、分析 速度等)。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n :分离效率(柱效)的量度
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器 色谱泵 检测器
废液
HPLC的仪器配置
溶剂 数据处理系统 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特(M. S. Tswett)
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理 ,开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
1906年正式命名
色谱法;Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科பைடு நூலகம்家
M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC?
一般情况下HPLC不是分析方法的首选 分析方法选择的大致程序(以药典分析方法为例):
待测成分的性质:极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立,有重要的指导意义。
样品情况的了解:
待测成分的结构特征:
对色谱柱的选择具有一定的指导意义(不是很明 显);
对检测器的选择具有指导意义, 如:含有生色团(助色团),紫外有吸收,特别 是芳香族化合物,可考虑使用紫外检测器
待测成分的含量:
决定对柱效的要求(柱效高,可有较低的检测限) 决定对检测器灵敏度的要求
UV/Vis检测器
目前实验室中最流行的选择 约75%的HPLC检测器配备的是UV/Vis(其中50% 是可变波长,25%是PDA) 吸光度与样品浓度呈线性关系
在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
UV/Vis的 优点
简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术
可以作梯度实验并且是非破坏性的
大多数有机化合物有一定程度的吸光度
OH
CH3
维生素
荧光检测器的优点
选择性提高
灵敏度提高(在 pg/fg 范围)
低背景技术
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 -0.10 5.00
6.894
的相对大小。 α = k2/ k1
k
α是分离因子,描述两个被分离组份容量因子 n是理论塔板数,描述组分被保留的程度以及
色谱峰谱带展宽的程度
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
除分离度之外,在设计色谱方法时,以下几个因 素也都要考虑: 灵敏度 载样量 成本 容易使用(简单)
分析速度
溶剂损耗
色谱柱寿命
根据评价液相色谱方法的标准, 进行试探性工作
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品(标准品)的配制方法 流动相:种类及配比,等度或梯度? 固定相:色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数:流速 检测器及相应参数:如紫外检测波长,灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法;亦称 色谱分析条件。
背景吸收的影响
吸光度
理想
2
1
实际
1
0
背景吸收降低 了线性范围
背景吸收
0
多数流动相有 背景紫外吸收
浓度
荧光(Fluorescence)检测器
发荧光的化合物吸收光(UV或VIS),其分子达到 激发态,其返回到基态时发射光的现象即荧光。
1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态,分子达到 不稳定的高能量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能,并达到最低的 激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象
S
N
常用液相色谱的检测器
常规检测器
示差折光检测器(Refractive Index)
紫外/可见光吸收检测器(UV-Vis) 荧光检测器(Fluorescence) 蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering) 其他检测器(Other Detectors)
高端检测器
光电二极管矩阵检测器(Photodiode Array PDA) 质谱检测器(Mass Spectrometry)
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