3酶的分离纯化
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶的分离纯化
二、酶纯化过程的三个阶段
粗蛋白(crude 粗蛋白(crude protein)
采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。
部分纯化(partially 部分纯化(partially purified) 初步的纯化，使用
各种柱层析法。
均质纯化(homogeneous) 均质纯化(homogeneous) 目的酶的进一步精制，
二、抽提
细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：
普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。
抽提条件的选择：
一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 PH2～ PH2～6的水溶液 PH8～12的水溶液 PH8～12的水溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
饱和度调整
加入固体盐。不增大 溶液体积。 饱和溶液。原溶液体 积不大。 透析平衡法
541× ( S 2 − S1 ) g= 1 − 0.3 × S 2
100 × (S2 − S )1 v= 1 − S2
4) 影响盐析的因素
(1)pH
接近于待纯化酶的等电点。
(2)温度 (2)温度
从酶的稳定性和溶Байду номын сангаас度看，盐析温度一般以控制 在30℃左右为宜。 30℃
1 2 3 4
机 破碎 理破碎 化 酶 破碎 破碎
DY89-I 动 匀 机 细 胞 破 碎 珠
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
酶学第三章酶活性的测定及分离纯化
第三章酶活性的测定及分离纯化在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。
酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
3.1 酶活性单位酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。
酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。
3.1.1 实用单位不同的酶采用不同的标准。
如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。
ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。
3.1.2 国际酶活性单位1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。
这是酶活性的国际单位。
3.1.3 Katal1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。
1 katal＝6×10u。
3.1.4 转换数在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可表示为：1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。
3.1.5 比活性酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。
酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。
酶的分离纯化(上)
sephacyl S-系列，是适合N,N’-甲叉双丙稀酰胺 交联成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶性系统，也适 用于有机溶剂或高浓度氢链解离试剂存在的系统。
② 聚丙烯酰胺凝胶
如：Bio-Gel P-系列，是聚丙烯酰胺与交联剂 N,N’-甲叉双丙稀酰胺共聚得到的交联凝胶。 P-后的数字乘以1000，表示凝胶用于分离 的最高分子量。
二、酶源选材：
1、目的酶含量要丰富 2、取材要方便 3、成本经济低廉 三、建立适当的纯化方法和活力检测方法
即要考虑：高灵敏性、准确性、所用仪器试 剂，又要注意纯化方法经济实效，多种方法 配合使用。
Section 2 酶的提取
提取的目的：将尽量多的酶和尽量少的杂质 从原料引入溶液。
一、预处理和细胞破碎： 材料要新鲜或冰冻 1、动物材料要去结缔组织和脂肪组织。 2、植物种子要先脱脂。 3、微生物则应将菌体和发酵液分离。
分辨率Rs=两峰带间距离/峰带宽，当Rs=1.2时， 基本达到要求。
*分辨率Rs与层析柱的大小及柱长有关，一般的 是Rs∝L½ ， L为柱长。但柱太长时，流速又 应为f=p·r²/L,p为压强，r为柱半径。
柱太小时，可能产生壁效应，发生拖尾现象
柱太大时，可能产生稀释效应以及峰形不均匀
所以柱长与内径应有适当的比例，常用的为 1/20~1/40
细胞破碎
1、机械破碎：
高速组织捣碎 （中等） 植物种子
手工匀浆、研磨（温和） 动物组织
球磨
（剧烈） 微生物
2、理化方法：
超声波破碎 125w 5min 细菌
化学溶胀
红血球
酶解
细菌
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
酶的分离纯化
酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。
酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。
现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。
一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。
酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。
常用于微生物的微生物材料的破碎。
匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶的分离
大多数蛋白类酶都溶 于水，而且在低浓度 的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度 的升高而增加，这称 为盐溶现象。
在盐浓度达到某一 界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而 降低，这称为盐析 现象。
举例说明
盐溶液提取
例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞 外酶，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液提取等。有少数酶，如 霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。 核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取 液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶 RNA。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀 法 等电点沉 淀法 有机溶剂 沉淀法 复合沉淀 法
利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解 度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度 的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀， 从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以 及不同的两性电解质有不同的等电点这一特 性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀 析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不 同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶 或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合 物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
三 、离心条件
在离心过程中，应该根据需要，选择好离心 力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温 度和 pH 值等条件。
1.
离心力
相对离心力
2、离心时间 3、温度和 pH 值
（三 ） 过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形 状的物质分离的技术。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、 纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以 各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜 分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析及电 渗析等都属于膜过滤技术。
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
酶的分离纯化
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子 间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜 的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破 坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
基本原理
➢ 有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极 性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋 白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
➢ 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋 白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子 的水膜，因而发生沉淀作用
1、中性盐沉淀
➢ 中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所 以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜， 暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水 胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
➢ 优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操 作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作 用。
➢ 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低，这称为盐析 现象。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
酶的分离与纯化
● 鹽溶 Salting-in:
加鹽使蛋白質溶入水溶液中
● 鹽析 Salting-out:
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
設計純化步驟時，需考慮下列各項要求
• • • •
a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
組合純化步驟
• a. 組合標準 • (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行， 有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠 体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法， 組成全部流程。 • (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純 化，看其結果如何再加改進。 • (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化， 如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑 制劑或熱穩定性等。
• 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影 響結果的好壞： • (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本 在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在 膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造 成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析 力降低甚多。 • (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体 時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗 等。
近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不 論人類或是分子皆同
色谱的类型
. 常用的層析方法
膠體過濾法
• 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩 衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分 佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球， 隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內 的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、 大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但 一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響 力。
酶工程3 第三章：酶的分离纯化
3.3.1 细胞破碎的方法
机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73
3.3.2酶提取的方法
根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。
盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 p76
3.3.3影响酶提取的主要因素
1 提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－
1 分离过程中新设备、新技术的应用会取得 事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。 采用膜分离技术等。
2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失 活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。
3.4 沉淀分离
沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀
收集沉淀
10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提 取。
2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH 不宜过高或过低，防止酶失活。
3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离 成本提高。一般为原液的3-5倍
4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶 或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损 失。
提取时的注意事项
N－末端分析 只适用于一条肽链
免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
3.3分离与纯化
分离（提取）：在一定条件下，用适当的
溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。
纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法
（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶， 再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一 性，将酶纯化。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
3.5 离心分离
借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小密度的物质分离的技术。
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2、酸溶液提取、碱溶液提取
酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶 液提取。
原则：
蛋白质提取液的pH值首先应保证在蛋白质稳定的 范围内，即选择在偏离等电点两侧。 如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏 碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取；
三硬脂酸酯 ) 用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一 步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。
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四、酶学破碎法
在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶 的作用，使细胞破碎。 1、外加酶
简单原理:溶菌酶处理时，它能水解构成枯草 菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。 尤其卵白中含量高，而多易结晶化。
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第二节 酶的提取
是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使 酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。
目的: 让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然 状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏
大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。 因此蛋白质的提取一般以水为主。
稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也 是提取蛋白质的最常用溶剂。
或:
将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰 浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
2、压力差破碎法
高压冲击法 用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英 沙等混合物。 突然降压法 加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压 爆破性减压法 用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。 渗透压差法 利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋 微生物中提取某些酶。
3、超声波破碎法
在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程
度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大。
操作条件
频率 10~20KHz，功率100~150W，温 度0~10oC， pH4~7，时间3~10min， 间隔多次;对数生长期细胞，细胞浓度和溶 液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz声波 或10～500kHz超声波所产生的机械振动， 只要有设备该法方便.且效果也好，但一次 处理量较小;应用超声波处理时应注意避免 溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的 蛋白质酶时宜慎重。
一、机械破碎法
原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞 1 机械捣碎法：捣碎机，10000rpm，实验、生产规 模
均可 2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，
效率较低 3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞
破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。
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二、物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因 素的作用使组织细胞破碎
肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱 提取；
某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式 存在，选择pH3～6范围对于分离提取是有利的。
3、有机溶剂提取
与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机 溶剂提取。 有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂 结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐 或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。 例: 从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含 多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。 因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与 水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可 占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合， 使蛋白质在水中溶解能力大大增加。
包括:
1、温度差破碎法; 2、压力差破碎法; 3、超声波破碎法;
1、温度差破碎法
冷冻 高温，用于脆弱易破菌，难以工业化;
于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢 地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。 由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将 细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋 白冻结变性。
2、表面活性剂
表面活性剂(溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和 细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构 破坏，增加膜的透过性。 离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。 常用的非离子型表面活性剂为：
Triton(辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚 );
, Tween(聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯,吐温 聚氧乙烯山梨醇酐
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三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结 构改变或破坏。
1、有机溶液
有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂 结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶 或胞内酶等释出胞外。
操作
粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅 速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。 蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量 乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。
2、自溶法
将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋 白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。
自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污 染。于温室30℃左右较早溶化。 自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。 自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制 备活性蛋白质时较少用。 适宜的自溶条件：温度、pH值、离子强度等 加入噬菌体感染细胞 电离辐谢
一、酶提取的主要方法
1、盐溶液提取
盐溶现象: 在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加. 盐析现象: 当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出.一 般采用稀盐溶液，0.02~0.05mol/L。
等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸 盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如 6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。
1g菌体加1～10mg溶菌酶， pH6.2～7.01h内完全溶菌。于 生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原 形质没有脱出。
蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌酶 能专一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键。 革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。 酵母：其细胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖 酶； 霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶； 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。