结核分枝杆菌的核酸检测参考课件
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▪ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无 论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。
▪ 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.
3/31/2020
2
3/31/2020
结核分枝杆菌核酸检测
增加分子生物学阳性可以作为确诊标
准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学 、分子生物学）检查为主，结合流行病 史、临床表现、胸部影像、相关的辅助 检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出 诊断。以病原学、病理学结果作为确诊 依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影 像学检查支持即可确诊。
Xpert MTB/RIF
一种半巢式实时荧光PCR体外诊 断技术，可以检测结核分枝杆菌以 及利福平耐药性；
针对rpoB基因81bp利福平耐药 核心区间（RRDR）设计引物、探针 。5个探针结合到野生型，而不是突 变体目标。每个探针用不同的荧光 染料标记，允许同时检测。
3/31/2020
8
痰标本与处理液 1：2混合
结核分枝杆菌核酸及 血清学检测
唐媛媛 潍坊市第二人民医院 检验科
2
1
结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸 序列；
阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除 核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝 杆菌。
结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、 IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等
环介导等温扩增仪（TB-LAMP）
体外定性检测结核分枝杆菌复合群； 在恒温条件下进行基因扩增反应； 4种引物识别6个区域，特异性高； 扩增反应效率高，67℃，40min。 主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较 小，而且试剂成本较低。
3/31/2020
11
传统实时荧光定量PCR检测
目的：定量检测人标本中的结核分枝杆菌核酸 原理：PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计
耐药结核 ✓当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重 时，应使用Xpert MTB/RIF做初始诊断；
肺外结核 ✓所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本 进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF 做初 始诊断
3/31/2020
7
GeneXpert
吸取2ml处理样品 到反应盒
系统内自动完成
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR反应 试剂混合
半巢式实时荧光 定量核酸扩增检
测
打印检 测报告
将反应盒放入检测模块 （手工操作完成）
3/31/2020
获得检测结果时间：1小时50分钟
9
MTB/RIF检测对MDR-TB的防控
“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最 为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。
3
常用技术
传统实时荧光定量PCR检测 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 环介导等温扩增检测 实时荧光核酸恒温扩增检测 交叉引物恒温扩增检测 基因探针检测
3/31/2020
4
抗酸染色
1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB
每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一
1.假阳性率高 2.结合抗酸染色
认证
3/31/2020
13
样本类型（一）
抗酸杆菌涂片镜检：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本
分枝杆菌分离培养：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液
实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的办法。
3/31/2020
12
目的基因片段 方法
时间 检测敏感度 优点
缺点
Xpert MTB/RIF
rpoB 半巢式实时荧光PCR
TB-LAMP
gryB及IS6110 环介导恒温扩增
结核杆菌DNA
IS6110 实时荧光定量PCR
2小时
结核分枝杆菌的核酸检测：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液（GeneXpert除外）、病理切 片
3/31/2020
14
样本类型（二）
分枝杆菌菌种鉴定 临床分枝杆菌分离培养物
1小时
131菌条/ml
100菌条/ml
全自动、同时检测利福 67℃恒温扩增，扩增
平耐药基因、特异性高，时间短，特异性高，生
生物安全性高
物安全性高
2.5小时
1000～10000菌条/ml
适合大批量筛查，低费 用
Hale Waihona Puke Baidu
最多一次同时检测八个 标本用量较少，除痰标 假阳性，易污染，需专
样本
本以外的标本需进一步 业人员操作
2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.
荧光染色
3/31/2020
5
结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
3/31/2020
6
2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 ✓所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 ✓对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断
▪ 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.
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结核分枝杆菌核酸检测
增加分子生物学阳性可以作为确诊标
准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学 、分子生物学）检查为主，结合流行病 史、临床表现、胸部影像、相关的辅助 检查及鉴别诊断等，进行综合分析做出 诊断。以病原学、病理学结果作为确诊 依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影 像学检查支持即可确诊。
Xpert MTB/RIF
一种半巢式实时荧光PCR体外诊 断技术，可以检测结核分枝杆菌以 及利福平耐药性；
针对rpoB基因81bp利福平耐药 核心区间（RRDR）设计引物、探针 。5个探针结合到野生型，而不是突 变体目标。每个探针用不同的荧光 染料标记，允许同时检测。
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痰标本与处理液 1：2混合
结核分枝杆菌核酸及 血清学检测
唐媛媛 潍坊市第二人民医院 检验科
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1
结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸 序列；
阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除 核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核分枝 杆菌。
结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、 IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等
环介导等温扩增仪（TB-LAMP）
体外定性检测结核分枝杆菌复合群； 在恒温条件下进行基因扩增反应； 4种引物识别6个区域，特异性高； 扩增反应效率高，67℃，40min。 主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较 小，而且试剂成本较低。
3/31/2020
11
传统实时荧光定量PCR检测
目的：定量检测人标本中的结核分枝杆菌核酸 原理：PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计
耐药结核 ✓当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重 时，应使用Xpert MTB/RIF做初始诊断；
肺外结核 ✓所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本 进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF 做初 始诊断
3/31/2020
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GeneXpert
吸取2ml处理样品 到反应盒
系统内自动完成
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR反应 试剂混合
半巢式实时荧光 定量核酸扩增检
测
打印检 测报告
将反应盒放入检测模块 （手工操作完成）
3/31/2020
获得检测结果时间：1小时50分钟
9
MTB/RIF检测对MDR-TB的防控
“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最 为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。
3
常用技术
传统实时荧光定量PCR检测 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 环介导等温扩增检测 实时荧光核酸恒温扩增检测 交叉引物恒温扩增检测 基因探针检测
3/31/2020
4
抗酸染色
1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB
每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一
1.假阳性率高 2.结合抗酸染色
认证
3/31/2020
13
样本类型（一）
抗酸杆菌涂片镜检：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本
分枝杆菌分离培养：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液
实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的办法。
3/31/2020
12
目的基因片段 方法
时间 检测敏感度 优点
缺点
Xpert MTB/RIF
rpoB 半巢式实时荧光PCR
TB-LAMP
gryB及IS6110 环介导恒温扩增
结核杆菌DNA
IS6110 实时荧光定量PCR
2小时
结核分枝杆菌的核酸检测：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺 活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液 、创伤标本、大便标本、血液（GeneXpert除外）、病理切 片
3/31/2020
14
样本类型（二）
分枝杆菌菌种鉴定 临床分枝杆菌分离培养物
1小时
131菌条/ml
100菌条/ml
全自动、同时检测利福 67℃恒温扩增，扩增
平耐药基因、特异性高，时间短，特异性高，生
生物安全性高
物安全性高
2.5小时
1000～10000菌条/ml
适合大批量筛查，低费 用
Hale Waihona Puke Baidu
最多一次同时检测八个 标本用量较少，除痰标 假阳性，易污染，需专
样本
本以外的标本需进一步 业人员操作
2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.
荧光染色
3/31/2020
5
结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
3/31/2020
6
2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 ✓所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 ✓对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断