一种简单快速植物组织冰冻切片方法

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微小组织快速冰冻切片法

微小组织快速冰冻切片法

微小组织快速冰冻切片法自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。

随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。

为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。

1材料与方法1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。

②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。

③组织包埋托的改进:找一直径为0.8~1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3~4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。

④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。

1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。

②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。

③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。

使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3~5 μm。

④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5~10 s。

⑤染色:苏木素1~2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。

实验三 植物冰冻切片制作及显微观察

实验三 植物冰冻切片制作及显微观察

植物冰冻切片制作及显微观察一实验原理冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法,因其不需经过脱水和透明等步骤,具有快速、简便、易操作等特点,而且能比较好地保存组织的酶活性,较完好地保存组织抗原的免疫活性,是原位杂交、酶组织化学和免疫组织化学等实验中常用的方法。

冰冻切片的种类较多,常用的切片机主要分为两大类:开放式冰冻切片机和恒温冰冻切片机。

前者主要包括半导体制冷切片机、醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片机等,开放式冰冻切片机由于暴露于空气中,温度不易控制,技术难度大,现多已淘汰。

后者主要是低温恒冷箱冰冻切片法,是目前应用最为广泛的方法。

冰冻切片在动物和人体的研究中已被广泛应用,但在植物上的应用相对较少。

原因是植物组织中存在液泡结构,而且由于细胞壁的存在细胞之间有较大间隙,细胞含水量远大于相同体积的动物细胞,更容易在低温冷冻过程中形成冰晶,损伤植物细胞的细微结构且比较容易破碎,难以切片和保持植物组织结构的完整性,也使得准备植物组织的冰冻切片存在一定的困难。

因此,在植物材料进行冷冻切片时常使用冷冻保护剂进行处理。

冷冻保护剂的作用就是能与组织细胞中的水分结合,降低细胞内溶液的冰点,使形成冰晶或较大冰晶的机会减小,从而减轻细胞内冰晶的损伤。

常用的的冷冻保护剂有蔗糖和甘油等,不同植物组织细胞结构不同,因此选择适合的保护剂的浓度非常重要。

另外,影响植物冰冻切片的主要因素还有包埋剂和切片厚度等,冰冻切片常用的包埋剂有水、普通胶水和OCT,用水做包埋剂,较难切出完整的切片;OCT包埋剂与普通胶水效果基本相同,都能切出完整的切片,如果在冰冻前将材料浸没在OCT或胶水中,让OCT或胶水充分渗透进组织中,切片效果更好。

切片不可过厚,否则细胞重叠不易观察;切片也不可过薄,否则切片容易破碎,需根据不同实验材料和实验目的进行优化。

二实验材料拟南芥茎段三主要仪器和试剂leica冰冻切片机、光学显微镜OCT、TBO、四实验方法1.取新鲜烟草茎段,切成0.5 cm左右的小段2.取出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上,冰冻。

不可错过的【冰冻切片制备】步骤!

不可错过的【冰冻切片制备】步骤!

不可错过的【冰冻切片制备】步骤!Frozen section01什么是冰冻切片?冰冻切片(frozen section)是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便,而多应用于手术中的快速病理诊断。

02制备步骤将组织在恒温冷冻切片机里切片。

冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃,根据不同组织调节不同的腔温,平时应将冷冻头放置于冷冻台上。

冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。

1)当冰冻组织取好后,在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替),放上组织,速冻;2)待组织冻结后,将冷冻头装到切片机上;3)粗切,修出切面细切几张,用毛笔刷去刀上组织片;4)放下抗卷板,开始切片,切片厚度一般为5~6微米,切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇冰醋酸液(97ml甲醇+3ml冰醋酸)中固定,固定时间为10~20秒;03注意事项1)速冻:是冰冻切片的关键,因为只有速冻才能减少组织内的冰晶,最好的办法是将速冻头迅速压在组织上,冻好后就可切片。

特别适用于较脆的组织。

而含有脂肪较多的组织,最好放在液氮里处理。

在液氮里冷冻要注意不要冻过头,2~3秒钟就要拿出来看一下,只要有4/5的组织已经冻住就可以了,待冷冻头拿出后刚好全部冻住,否则就会引起组织发脆,或冷冻头与组织分离。

2)固定:切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。

固定液有很多种,甲醇作用快,收缩小,染色较清晰,是冰冻切片最理想的固定液,而每97ml加入冰醋酸3ml,会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。

3)包埋剂:可用普通胶水代替,但要加入适量的水(胶水与水的比例大约在2:1左右)。

太稀了,容易损伤切片刀;太稠了,粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。

4)冰冻用切片刀不仅要磨的快,而且要磨的直,否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。

最好能使用一次性刀片。

5)如组织发脆,可等几分钟后再切,也可用手在组织上稍稍加温;如果用手去摸组织块,最好戴手套,或用玻片间的纸夹在手与组织之间,以防感染。

冰冻切片实步骤

冰冻切片实步骤

冰冻切片实步骤全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋(冰冻切片机内)4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤:冰冻切片4~8μm,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3次。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS冲洗,5分钟×2次。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。

(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗冰冻切片不能用热修复啊以下是我的步骤:1 冰冻切片室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS 洗,5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟,PBS洗,5分钟×2。

2 5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。

倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

3 PBS冲洗,5分钟×3次。

4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育30分钟。

PBS冲洗,5分钟×3次。

5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。

6 PBS冲洗,5分钟×3次。

7 显色剂显色(DAB)。

8 自来水充分冲洗,复染,封片。

冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶,最好是用3%H2O2/甲醇溶液,室温20分钟。

此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次新鲜配制。

冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗,5分钟×2。

下接免疫组化染色操作步骤。

免疫组化染色步骤:(SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。

植物切片制作

植物切片制作

植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术,是人们认识植物体结构的有效手段,已成为植物生物学的重要组成部分.植物制片技术已建立了许多方法,现简要介绍如下几种最常见的制片技术:徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。

徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片,所作的切片通常不经染色或经简单染色后,制成临时的水装片用于观察,亦可以通过脱水与染色制成永久制片。

优点:简单、方便,不需要复杂的设备,不经过化学药物的处理,基本上保留了植物活体的状态。

用品与材料显微镜、载(盖)玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中,便于手持的材料,可将实验材料截成适当小块,一般以长2~3cm,切片断面不超过3~5mm2为宜。

对于过于柔嫩的器官(如叶片等),一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物,包被住材料后再进行切片。

有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片. 实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。

2、用左手拇指、食指和中指拿住材料,拇指略低于食指与中指,并使材料略为突出在指尖上面。

3、右手持刀,将刀片平稳地放在左手食指之上,与材料切面平行,然后以均匀的动作,自左前方向右后方,斜着向后拉切,切时用臂力而不用腕力。

4、切下许多薄片后,用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中.用毛笔挑选透明的薄片,放在载玻片上,用吸管滴一滴水在载玻片上,盖上盖玻片,制成临时装片进行观察。

注意事项1、在切片前,要不断地用水湿润材料和刀片。

2、切片时,两只手应该保持活动状态,不要使它们紧靠身体或实验台,且用力不要过猛,不能用刀片挤压材料或来回切割材料。

3、动作要敏捷,材料要一次切下,不要追求切片形状的完整。

简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片,可以进行简单的组织化学染色,这样更容易分辨细胞的结构,同时可以观察到细胞各部分的化学成分。

小鼠脑组织冰冻切片步骤

小鼠脑组织冰冻切片步骤

小鼠脑组织冰冻切片步骤
嘿,朋友们!今天咱就来讲讲小鼠脑组织冰冻切片那些事儿!这可是个技术活儿呢!
首先啊,你得把小鼠那小脑袋准备好呀。

就像厨师要准备好食材才能做出美味佳肴一样,咱得把小鼠的脑组织小心地取出来。

这可不是随随便便就能搞定的,得轻点儿、柔点儿,别把脑组织给弄坏喽。

然后呢,把脑组织放到专门的冰冻模具里。

这就好比给脑组织找了个小窝,让它舒舒服服地待着。

接下来,把模具放进液氮里速冻,那速度,可快啦,就像闪电一样!
速冻好了,就该切片啦!这就像是在给脑组织做造型呢,不过可得小心别切坏了。

切片机就像是个神奇的魔法工具,能把脑组织切成薄薄的一片片。

想象一下,那薄得像纸一样的切片,多神奇呀!
切好片后,把它们放到载玻片上。

这就像是给这些小切片找到了它们的舞台,准备开始它们的表演啦。

然后再进行一些处理,让这些切片能更好地展示出它们的秘密。

在这个过程中,每一步都得细心细心再细心,就像走钢丝一样,不能有一点儿马虎。

要是不小心出了差错,那可就前功尽弃啦!你说是不是?
哎呀,这小鼠脑组织冰冻切片可真是个有趣又有挑战的活儿呀!每一步都充满了奥秘和技巧。

只有用心去做,才能做出漂亮的切片,才能更好地去研究那些隐藏在脑组织里的秘密。

所以呀,朋友们,要是你们也对这个感兴趣,可得好好记住这些步骤,大胆地去尝试哦!相信你们一定能做出让自己满意的切片,去探索那些神奇的科学世界!这可不是开玩笑的哟,这是实实在在的技术活呢!加油吧!。

冷冻切片法流程

冷冻切片法流程

冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢!让我来给你讲讲它的流程吧。

一、准备工作。

咱得先把要用的东西都准备好。

像冷冻切片机得提前检查好,确保它能正常工作。

还有载玻片、盖玻片,这些小物件可不能少。

冷冻剂也得备足了,这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。

另外,取材工具也很重要,像手术刀之类的,要锋利又干净。

标本也是关键,要选取合适的组织,这个组织得具有代表性,就像选演员一样,得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。

二、取材。

这一步可不能马虎。

要快速地把组织取出来,为啥要快呢?因为时间一长,组织可能就会发生变化啦。

就像新鲜的水果放久了会烂一样,组织放久了结构可能就不那么准确了。

取出来的组织大小也要合适,不能太大也不能太小。

太大了放不进切片机,太小了又可能切不到想要的结构,就像穿衣服一样,得不大不小刚刚好。

而且在取材的时候,要尽量减少对组织的损伤,这组织可是很“娇弱”的呢。

三、冷冻。

把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。

这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。

冷冻的温度得调好,不能太冷也不能不够冷。

太冷了可能会让组织变得太硬,容易碎掉,就像冰块掉地上容易裂一样。

不够冷呢,组织又切不好,软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。

在冷冻的时候还要注意观察组织的状态,就像看着锅里的菜有没有熟一样。

四、切片。

等组织冷冻好了就可以切片啦。

切片的时候手要稳,就像绣花一样。

切片的厚度也很有讲究,太厚了看不清楚细胞结构,太薄了又容易切坏。

这就需要不断地练习,找到那种恰到好处的感觉。

而且切出来的切片要完整,不能缺边少角的,不然就像漂亮的拼图少了几块,多可惜呀。

五、贴片。

切好的片子要贴到载玻片上。

这个时候要小心操作,就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。

要确保片子贴得平平整整的,不能有褶皱,要是有褶皱就像衣服没熨平一样,看着就不舒服,而且还会影响观察呢。

六、染色。

贴片完成后就可以染色啦。

染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服,这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。

冰冻组织切片样品制备方法

冰冻组织切片样品制备方法

冰冻组织切片样品制备方法组织采集后,经固定、冷冻、切片、晾片,方可进行免疫抗体标记。

1、组织的采集、固定和保存:不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而考虑采用不同的固定和保存方法。

此处介绍几种实验室常用方法。

液氮冷冻法:采取新鲜组织后,即可放入液氮中,并保存于液氮中。

固定法:采取新鲜组织后,4%多聚甲醛(4%PFA)4︒C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜,PBS缓冲液洗三次,每次10-30min,20%蔗糖中浸泡1小时或过夜,4︒C保存于20%蔗糖(含0.05%NaN3)中。

2、组织的冷冻和切片:组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同。

使用冷冻切片机,将组织冰切成4-20μm的切片,粘贴于处理过的载玻片上,室温干燥1小时后,可进行免疫标记。

或放入载片盒,-80︒C密闭保存。

气体CO2冷冻法:将样品置于样品台的OCT中,打开钢瓶开关,CO2气体喷出,迅速冷冻组织样品。

干冰冷冻法:(适合小块和致密度低的组织,如胚胎、小块组织、活检组织等)将小组织块放入冷冻包埋模具中,调整切面位置(必要时可在体视镜下操作)后,置于干冰上(暂时无干冰,可置于-80︒C),待冷冻完全后,-80︒C密闭保存。

●直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冰切机(箱体温度-80︒C)中直接冷冻。

3、冰冻组织切片的免疫荧光标记:将冰冻组织切片从-80︒C 冰箱中取出,室温放置10min, 待切片回温并干燥,PBS 10min 洗去OCT,可无需Triton处理,即可进行免疫抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同。

4、冰冻组织切片的免疫酶反应:(酶联免疫反应,在抗体作用之前或显色时组织样品需进行内源性酶抑制作用,以降低反应背景)碱性磷酸酶(AP):密封保存的组织切片PBS 5min↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗(稀释过)室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-AP(稀释过)室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: AP-CDS 5min⨯ 2↓NBT4.5μl/ml、BCIP3.5μl/ml in AP-CDS 室温或37︒C 5-30min↓TE 室温10min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片辣根过氧化物酶(HRP):密封保存的组织切片PBS 5min↓3%H2O2.10% MeOH in PBS 室温3min↓PBS 5min⨯ 3↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗(稀释过)室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-HRP(稀释过)室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: HRP-CDS室温20-30min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片。

植物组织切片

植物组织切片
4
脱水
• 固定好的材料经各级酒精脱水至纯酒精。 各级酒精的浓度为:30%、50%、70%、 85%、95%和l00%。(自动脱水机 )
5
透明
• 纯酒精中的植物材料用l/2纯酒精和l/2二 甲苯混合液处理2~3h,转入纯二甲苯中, 处理两次。由于石蜡溶于二甲苯而不溶于 酒精,因此透明的作用除了使材料变得透 明外,另一方面是将材料中的酒精除去。
• 再将带有蜡片的载玻片放在温台上,温台 的温度在45℃左右,蜡片受热后慢慢伸直。 用滤纸吸去多余液体,表面烤干后,转入 30℃温箱放置一昼夜。
10
染色和封片
• 切片干燥后,可以选用不同的染色法染色。 染色前先要进行脱蜡,使材料内外的石蜡 溶解。然后根据配制染液的溶液情况,决 定是否需要复水。下面以植物生物学中最 常见的番红-固绿染色方法
11
植物组织永久制片
• 一、徒手切片法 • 二、滑走切片法 • 三、离析法 • 四、压片法 • 五、石蜡切片法 • 六、冰冻切片法
1
石蜡切片法
石蜡切片法是用石蜡作为包埋剂的一 种显微制片方法,是显微技术中最重要最 常用的方法之一。它的优点是能够切出薄 而均匀的连续切片,便于进行器官的三维 重构。此法多用手摇切片机切片。对于较 硬的材料,也可以使用滑走切片机。 石蜡切片法的操作程序包括:取材、固定、 脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、 粘片、染色和封片。
2
ห้องสมุดไป่ตู้
取材
• 选取生长良好、有代表性的目标材料,洗 净。用锋利的双面刀片截取材料,动作要 迅速。材料的大小不超过0.5~lcm3。
3
固定
• 将选取的材料放人固定液中,固定液的体积大约 是材料的20倍。固定是用化学试剂迅速杀死细胞 的过程。目的是尽可能使细胞中的各个组分保持 生活状态的结构,并固定在它们原来的位置上。 常用的固定剂有:FAA 、卡诺和纳瓦兴固定液。 【FAA是Formalin-Aceto-Alcohol(福尔马林-乙酸 -乙醇)混合液的缩写,配法:50%或70%酒精90 毫升, 冰醋酸 5毫升, 福尔马林, 5毫升。柔软材料 用50%酒精,坚硬材料用70%酒精配制。】

冰冻切片制作方法与注意事项

冰冻切片制作方法与注意事项

冰冻切片制作方法与注意事项一、固定:固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀,停止发生死后组织变化,尽量保持其活体状态的过程。

固定的方法有浸泡固定法,注射、灌注固定法,蒸汽固定法,本实验用的是注射、关注固定法:某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定,就可采用灌注或灌流固定法。

固定时将固定液直接注入动物的血管,经血管分支到达整个组织或全身,从二十只得到充分固定。

固定液分为单纯固定液和混合固定液。

单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等,混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。

本实验用的固定液为4%甲醛(10%福尔马林)。

固定后的处理:用水配制的固定液固定后应用流水冲洗,可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。

对小动物和脑组织等,应以浸泡为主,即能达到冲洗的目的,又不损害组织.【注意事项】1.固定要及时.2.组织块的大小要合适。

3.应有足够的固定液,一般与组织块的比例为20:1,容器勿过小,组织勿过多。

4.固定时间要合适,甲醛固定液一般固定两天左右,第一天要更换一次固定液。

5.要进行促使固定,在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透,适当提高温度也可缩短固定时间。

6.选择合适的固定液。

7.一次取材数量过多时,应对取材部位和顺序进行编号,并及时做好记录。

二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程,使用的试剂称为脱水剂。

脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等,和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。

本实验所用的是乙醇脱水。

乙醇是最常用的脱水剂,其优点是脱水能力强,即能与水相混合,又能与透明剂相混,并可使组织硬化,便于切片.缺点是穿透组织的速度快,且容易使组织收缩、变脆.为克服这一缺点,在一般脱水中,应采用循序渐进的方法,逐步升级,经一系列不同浓度的乙醇,使组织中的水分逐渐被乙醇代替。

冰冻组织保藏和切片方法

冰冻组织保藏和切片方法

冰冻组织保藏和切片方法
高建
【期刊名称】《教学仪器与实验》
【年(卷),期】2004(020)009
【摘要】将厚的叶子、木耳子实体、蘑菇菌褶、较粗的幼根和茎等切成可以手拿方便的条块;将细小的材料如苔藓植物捆成束;将较薄的几个叶叠在一起;然后将它们放入冰箱冷冻室(-13℃),冷冻15分钟左右,即可取出迅速进行徒手切片,然后,作临时制片观察。

用此方法徒手切蘑菇的一片菌褶,在镜下可清楚地看见担子和担孢子。

【总页数】1页(P35)
【作者】高建
【作者单位】湖北省宜昌市夷陵中学,443002
【正文语种】中文
【中图分类】G4
【相关文献】
1.用于激光捕获显微切割的组织冰冻切片制作方法探讨 [J], 段仁杰;林爱琴;汪根莲;李铁臣;孙青
2.小鼠组织冰冻切片3种包埋方法效果比较 [J], 黄小雨;刘亚萍;付琳琳;董红燕;董富兴
3.冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究 [J], 陈高峰
4.三种冰冻切片冷冻组织块标记方法的比较 [J], 黄燚彬
5.γ-GT酶组织化学染色中低熔点石蜡切片代替冰冻切片的方法 [J], 郭爱华;郭文君
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一种简单快速植物组织冰冻切片方法( ) 热带亚热带植物学报 2008, 16 4: 386,389Jou rna l of Trop ica l and Sub trop ica l Bo tany一种简单快速植物组织冰冻切片方法3 宁代锋 , 尹增芳 , 张菁 , 孙海燕()南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京 210037摘要 : 比较不同冷冻方法对植物细胞超微结构的影响 , 结果表明 : 直接包埋法处理的植物细胞超微结构保存较好 , 而液氮冷冻处理的植物细胞内膜系统损伤严重。

建立了一种直接包埋冷冻和适当回温相结合的方法 , 不仅可以制作出植物细胞基本结构保存完整的组织切片 , 而且避免了使用冰冻保护剂的弊端。

其操作程序是 : 样品固定 ?冰冻与包埋 ?适当回温 ?快速切片 ?展片 ?染色。

此法制作的切片可进行不同的染色和组织细胞化学测定 , 具有操作简便 , 易于推广的特点。

关键词 : 冰冻切片 ; 直接包埋法 ; 液氮冷冻 ; 回温 ; 超微结构( ) 文章编号 : 1005 - 3395 2008 04 - 0386 - 04 中图分类号 : Q94 - 336 文献标识码 : AA S im ple and Rap id Cryo2section ing M ethod in Plan t T issue3ZHAN G J ing, SUN H a i2yan N IN G D a i2feng, Y IN Zeng2fang,( )Co llege of Fo re st R e sou rce and Environm en t, N an jing Fo re stry U n ive rsity, N an jing 210037 , Ch ina A b stra c t: The effec ts of d iffe ren t freezing trea tm en ts on u ltra struc tu re of p lant ce lls du ring c ryo2sec tion ing w e re comp a red. The re su lts show n tha t the ce ll u ltra struc tu re w a s we ll p re se rved w ith d irec t c ryoem bed m e thod, w h ile the endom em b rane system in the ce ll w a s in ju red seve re ly w ith liqu id n itrogen c ryop re se rva tion. W e p ropo sed a m e thod com b in ing w ith c ryoem bed and mode st thaw ing, by w h ich no t on ly cou ld ge t in tegra ted section s w ith the ba sic struc tu re p re se rved, bu t a lso cou ld avo id the abu se of u sing cyro 2p ro tec ted reagen t. The p rocedu re con sisted of seve ra l step s a s fo llow s: fixing ? refrige ra tion and em bedd ing ? mode st thaw ing ? rap id sec tion ing ? sec tion flatting ? sta in ing. The sec tion s m ade by d irec t c ryoem bed w ith mode st thaw ing cou ld be sta ined and chem ica l de te rm ined in d iffe ren t ways. B e side s, the cha rac te ristic of th is p rocedu re is simp le and ea sy to be p romo ted.Key word s: C ryo sec tion ing; C ryoem bed; L iqu id n itrogen c ryop re se rva tion; Thaw ing; U ltra struc tu re植物组织冰冻切片作为一种快速、简便、高效、损伤细胞的内膜系统 ,影响其在植物细胞学研究中的应用。

为了解决上述植物冰冻切片中存在的易操作的技术 , 可以缩短常规石蜡切片缓慢而复问题 , 本文采用直接包埋冷冻和适当回温相结合杂的处理过程 , 减少对样品组织结构的损伤。

在的方法 , 取得了较好的切片效果。

细胞免疫化学和原位杂交等研究中 , 冰冻切片能更好地保存细胞内生物分子的活性 , 显示出独特 1 材料和方法作用。

冰冻切片技术在动物和人体的组织研究中[ 1- 3 ] 1. 1 材料已广泛应用 , 但由于植物细胞含水量大 , 在低实验材料选取南京林业大学校园苗圃内南林 95温冰冻过程中容易形成冰晶 , 硬度变大 , 难以切出( ) 杨Pop u lu s ×eu ram e ricana‘N an lin95π1 a生茎。

结构完整的组织切片 , 而且细胞内产生的冰晶会收稿日期 : 2007 - 08 - 13 接受日期 : 2007 - 11 - 23( ) ()基金项目 : 国家自然科学基金项目 30671657 ; 江苏省自然科学基金项目 B K2005132 资助 3 通讯作者 Co rre spond ing au tho r1. 2 植物材料的冰冻处理方法埋剂 , 切片即刻附着在解剖针上 , 随后用解剖直接包埋法启动切片机降温开关 , 使箱温切片转移到机箱外的载玻片上展片。

染色, 一般不需待切片完全展开时降低并维持在 - 20?, 冰冻台的温度降低到 - 20?。

殊处理就可以直接在切片上进行染色或组织将经过预处理的材料包埋 , 然后转入冰冻切片机内分析。

如图版 ?: 1 所示 , 杨树茎横切面结的样品台上 , 使材料迅速冷却并固着在样品台上。

整 , 未出现细胞结构破损的现象。

图版 ?: 2 液氮冷冻法液氮冷冻法是将材料经常规杨树茎细胞壁自发荧光的冰冻切片图像 , 杨方法固定和清洗后 , 先用包埋剂包裹在适当大小导管、木纤维细胞、韧皮纤维细胞及髓部薄壁的盒内 , 再用液氮迅速冷冻。

冷冻时间约为 20 s, 结构清晰。

随后尽快将样品移至冰冻切片机腔内 , 样品经 1 h左右的回温后再用包埋剂粘在样品台上进行冰冻 2 结果切片。

在电镜下观察不经过冷冻处理、液氮冷冻 1. 3 电镜制样观察和直接冷冻包埋的杨树 1 a 生茎薄壁细胞的结构 , 结果表明不经过冷冻处理的杨树茎薄将直接包埋和液氮冷冻的材料回温后分别进胞结构完整 , 可以观察到细胞内清晰的液泡膜行常规电镜制样 , 超薄切片机切片 , 醋酸双氧铀和及细胞核、线粒体、质体、内质网等细胞器的膜柠檬酸铅染色 , H 2600型透射电镜观察拍照。

() 图版 ?: 3 。

1. 4 冰冻切片的制作流程液氮冷冻处理后的杨树茎薄壁细胞的超构显示内膜系统损伤较为严重 , 由图版 ?: 5 样品固定 ? 冰冻与包埋 ? 适当回温 ? 快看出薄壁细胞质壁分离现象严重 , 细胞内质速切片 ? 展片 ? 染色观察样品固定将切取的杨树茎立即投入含( )4 %多聚甲醛、100 mmo l /L 磷酸缓冲液 pH 7. 2 的 , 质膜及部分细胞器的膜上出现嗜锇颗膜解体固定液中 , 4 ?下固定 2,3 h, 100 mmo l /L 磷酸缓观察中还发现部分细胞损伤极为严重 , 表现( )冲液 pH 7. 2 浸洗 2 ,3 次后备用 , 也可不固定直膜结构不清晰 , 细胞器解体 , 表明细胞膜系统接将新鲜组织进行包埋。

() 严重的破坏图版 ?: 6 。

冰冻包埋启动切片机降温开关 , 把箱温与液氮冷冻的材料相比 , - 20 ?条件下直降低并维持在 - 20 ?, 冰冻台的温度降低到 - 冻包埋的杨树茎薄壁细胞损伤程度明显较轻20 ?。

待冰冻切片机内的温度合适时 , 把经过预处泡膜结构清晰 , 细胞器结构完整 , 内膜系统上理的样品或新鲜组织直接用包埋剂包裹在样品台锇颗粒出现 , 但局部内质网库槽膨胀 , 部分细上 , 使材料迅速冷却并固着在样品台上。

包埋时选 () 现轻微的质壁分离现象图版 ?: 4 。

( 用进口包埋剂 OCT Op tim um cu tting temp e ra tu re3 讨论 ) compound, 涂抹均匀 , 使样品深埋其中。

植物细胞有细胞壁和大液泡 , 含水量大 , 回温处理把样品台连同已经冷却的材料温冰冻过程中容易形成冰晶 , 硬度变大 , 难以 , 拧紧机头的螺丝 , 摇动机身外移至切片机的机头结构完整的组织切片。

材料硬度太大是造成的旋转杠杆进行修块切片 , 直到切到自己需要的切片破碎的主要原因。

我们采用直接包埋和部位 , 此时的切片大部分都是破碎的 , 然后将样品回温相结合的方法 , 有效地解决了这一问题 , [ 4 ] 是把握最佳切片温度。

张建国认为最好是台连同包埋块拿出切片机箱 , 室温下放置 20 ,30s, 进行回温处理 , 使包埋块变软。

切片将回温处理后的样品包埋块迅速放尚有小部分组织未冰冻发硬时开始修出切片平入切片机箱进行切片 , 这样处理可切出较完整的 , 见切出最佳切片时即用载玻片吸贴试切数下μ切片 , 切片厚度为 10,20 m , 但切片过程必须在) 佳切片温度为 - 23 ,- 20 ?, 大约只有 10 s,15,20 s内完成 , 超过这一时间 , 材料会冻硬 , 切该温度切片易碎。

我们曾实验切未完全冻硬388 热带亚热带植物学报第 16卷b isbenzim ide H33258 Pneumocystis ca rin ii and L e ishm an ia 另外 , 植物组织低温冰冻会不可避免的造成con ta in ing m a te ria ls [ J ]. Pa rasito l R e s, 1998 , 84: 559 - 564. 冰晶损伤 , 而冰晶损伤会明显影响植物细胞的超 ) (张建国 . A new c ryo2section ing m e thod [ J ]. Ch in J [ 4 ] Zhang J G [ 7 ] 微结构。

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