细胞工程实验指导
《细胞工程》实验指导
细胞工程实验指导河北联合大学生命科学学院二零壹壹年七月邢朝斌目录实验一、植物组织培养培养基母液的配制实验二、植物组织培养的培养基配制实验三、康乃馨的离体快繁实验四、胡萝卜愈伤组织的建立实验五、组织培养物的继代培养实验一组织培养基母液的配制一、仪器及药品冰箱、天平（0.0001g）容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品蒸馏水二、方法和步骤：按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。
如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。
在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。
定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml。
微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。
逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。
铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）2.78 g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L。
植物细胞工程实验指导
实验一植物组织培养培养基的配制【实验目的】通过实验，掌握常用MS培养基的配制。
【仪器及试剂】1．仪器：：500 ml试剂瓶4个，100 ml试剂瓶4个，高压灭菌锅，电子天平，烧杯（大、中、小各2个），玻璃棒，移液管，搪瓷缸，培养瓶，电炉，pH计或精密pH试纸，容量瓶（大、中、小各1个）2．试剂：见MS培养基的配制方法一览表【操作步骤】1、母液的配制：为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液，这种浓缩液就叫“母液”。
①大量元素：一般配成使用浓度的10－20倍，浓度太大的母液在冰箱保存时会结晶。
除钙盐外，其它大量元素按一定倍数分别称量并分别用蒸馏水溶解后混合在一起，最后加蒸馏水定容。
钙盐要单独配制，不能和PO43-、SO42-混合，以免生成Ca3(PO4)2或CaSO4，发生沉淀。
②微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及精确起见常配成100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐个溶解并混合在一起。
③铁盐：微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5.56克和乙二铵四乙酸二钠（Na2-EDTA）7.46克溶于1升水中配成。
每配1升培养基加铁盐5毫升。
④有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，它们都是分别称量及分别用容量瓶配成所需浓度（0.1－10毫克/毫升），用时按培养基配方中要求的量分别加入。
这些化合物都易溶于水，直接用水配制。
⑤生长调节物质：一般配成0.1－1.0毫克/毫升。
生长素类IAA、NAA、2,4-D等，配制时先按要求浓度称好药品，置于小烧杯中，用1－2毫升0.1 N氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。
如果用少量95％的乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢氧化钠好。
配制细胞分裂素类物质时，则宜先用少量0.5 N或1 N盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。
陕师大细胞工程实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞工程的基本原理和实验技术。
2. 学习细胞培养、细胞融合、基因工程等细胞工程技术的操作方法。
3. 培养学生的实验操作能力和科学思维。
二、实验原理细胞工程是利用现代生物技术手段，对细胞进行改造、培养和应用的一门新兴学科。
本实验主要涉及以下原理：1. 细胞培养：在适宜的培养条件下，使细胞在体外生长、繁殖，为后续实验提供细胞材料。
2. 细胞融合：将两个或多个细胞合并成一个细胞的过程，可用于基因转移、细胞治疗等。
3. 基因工程：通过分子生物学技术对基因进行改造，实现特定性状的表达。
三、实验材料、试剂和仪器设备1. 实验材料：人胚胎肾细胞（HEK293）、小鼠成纤维细胞（NIH3T3）、小鼠血清、胰蛋白酶、DMSO等。
2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、Hoechst 33342染料等。
3. 仪器设备：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、PCR仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 细胞培养（1）将HEK293和NIH3T3细胞分别接种于培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）待细胞长满瓶底后，用胰蛋白酶消化细胞，按1:1的比例将两种细胞混合。
（3）将混合细胞接种于新的培养瓶中，继续培养。
2. 细胞融合（1）将混合细胞培养至对数生长期，加入适量的聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞接种于新的培养瓶中，继续培养。
（3）用Hoechst 33342染料检测融合细胞。
3. 基因工程（1）设计并合成目的基因的引物，进行PCR扩增。
（2）将扩增的目的基因克隆到载体上。
（3）将重组质粒转化到HEK293细胞中。
（4）用荧光素酶报告基因检测目的基因的表达。
五、实验结果与分析1. 细胞培养HEK293和NIH3T3细胞在培养过程中生长良好，细胞形态规则，细胞活力较高。
2. 细胞融合Hoechst 33342染料检测结果显示，部分细胞核融合，表明细胞融合实验成功。
3. 基因工程荧光素酶报告基因检测结果显示，目的基因在HEK293细胞中成功表达。
《细胞工程》实验教学(及含实验学分课程)大纲
《细胞工程》实验教学（及含实验学分课程）大纲《细胞工程》实验教学（及含实验学分课程）大纲一、课程基本情况课程编号：137B09G 学分：1 周学时：4 总学时：34 开课学期：3.1 开课学院：海洋学院课程英文名称：Experiment of cell Engineering 适用专业：海洋资源环境课程类别：专业方向模块课课程修读条件：生物化学、普通生物学网络课程地址: 无课程负责人：所属基层学术组织：生物与海洋科学系二、课程简介细胞工程学是应用细胞生物学、遗传学、分子生物学等的原理与方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性等，以获得具有目标性状的细胞系或生物体的有关理论和技术的学科。
它是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科，是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。
通过学习具体实验原理及操作，提高学生思考问题及动手的能力，为后续的实验学习及科学研究打下坚实的基础。
三、教学目标、任务该课程主要是巩固理论课学习的一些相关理论，提高学生的实际动手和操作能力，来更好的理解理论课学习的内容，培养学生的综合素质和逻辑思维能力，通过该门课程的学习，学生应该掌握实验仪器的使用，理论联系实际，更好的掌握理论课的相关知识，有能够综合运用理论知识来进行试验的综合设计的能四、教学方法与基本要求实验以操作为主，多媒体辅助教学和网络教学为辅。
学生实验前需预习实验指导书，在教师的指导下独立完成实验。
通过本实验课程培养学生动手能力，掌握最基本的操作技能。
五、主要内容及学时分配序号实验项目名称实验类型 (或上机类型) 实验类别时数每组人数 1 烟草愈伤组织诱导培养基的配置验证专业基础 3 2 2 烟草外植体的接种验证专业基础 3 4 3 观察愈伤组织的生长情况并补培养基配置和接种验证专业基础 3 4 4 烟草愈伤组织的继代及培养验证专业基础 3 4 5 烟草细胞培养设计专业基础 6 4 6 小鼠皮肤细胞的分离与接种培养综合设计专业基础 6 4 7 小鼠皮肤细胞的传代培养综合专业基础 6 4 8 生产转基因动物综合技术体系的方案设计综合演示专业基础 4 4 注：1.实验类型：演示、验证、操作、综合、设计、研究；上机类型：单项训练、综合训练。
细胞工程实验指导
.细胞工程实验指导编者刘清波黄红梅主审周朴华湖南农业大学植物科学实验教学中心二○○七年七月前言细胞工程是生物技术的主要内容之一，涉及的内容较广，主要包括：细胞培养、细胞融合、细胞拆合、生殖细胞、细胞转化等细胞水平的操作和技术。
目的是改良生物品种、生产生物产品或组分。
细胞工程依研究对象不同，分为植物细胞工程和动物细胞工程。
两者在研究内容及深度上已有较大的差别，最重要的差别是细胞全能性的表现。
植物细胞全能性已完全得到证实和发展，即培养一个植物活细胞可以得到胚状体以至得到完整植株，并且每一个植物活细胞都具有该物种的生命属性，在合适的离体条件下，这些特征属性均可表现出来。
动物细胞全能性证实工作直到1997年克隆羊“多莉”的培养成功才获得了阶段性突破。
细胞组织离体培养技术是细胞工程的基础技术和基本技能，也是基因工程、遗传工程等生命科学研究的重要手段。
它是通过无菌操作，把不同的操作对象，如细胞、组织、器官等外植体接种于人工配制的培养基，给予人工控制的环境条件，使培育对象表现生命特征。
本实验指导侧重于植物细胞组织培养技术，内容分为10个实验。
主要训练学生掌握植物细胞组织培养基本技能和操作要领，实验方法立足于初学者的专业基础和一般实验室的条件，将《细胞工程》课程的理论知识、一般的实验技能和科学研究的初步方法融为一体。
培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。
本实验指导供生物技术、生物工程等专业学生使用。
由于编者水平有限，加之时间仓促，错误在所难免，敬请各位师生批评指正。
编者2007．72目录实验一培养基母液配制 (3)实验二培养基配制与灭菌 (7)实验三植物器官愈伤组织的诱导 (9)实验四植物愈伤组织增殖 (12)实验五植物愈伤组织分化 (14)实验六植物器官型快速繁殖培养 (16)实验七花药培养及花粉发育时期的鉴定 (18)实验八植物茎尖培养 (21)实验九悬浮细胞培养 (23)实验十原生质体培养 (26)植物细胞组织培养植物细胞组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。
细胞工程学实验指导
实验一细胞培养的基本技术一、实验目的1、了解细胞培养室的设置、设备和基本要求。
2、掌握细胞培养用器械的清洗、消毒方法及无菌操作技术。
二、实验材料1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。
2、实验器材：不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。
三、实验步骤（一）器械的清洗1、玻璃器皿的清洗（植物细胞培养只需①、②操作即可）：①清水浸泡：浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。
②刷洗：将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。
烘干备用。
③浸酸：将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物。
浸泡时间要在6小时以上，最好过夜（用于动物细胞培养）。
④冲洗：浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。
再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（40~50℃）烘干（用于动物细胞培养）。
2、金属器械的清洗和消毒：金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。
3、胶塞的清洗和消毒：细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。
清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。
自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。
注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。
4、塑料物品的清洗：塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。
一般不用刷洗以防划痕和损伤。
清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自无菌材料进行接种或传代时，必须从各方面防止任何污染物进入容器，所以接种区的消毒至关重要。
由于接种区的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒灭菌（常用每立方米含2ml 甲醛和1g高锰酸钾的消毒液或6ml/m3乙二醇等加热熏蒸）。
每次接种前都应进行地面卫生清洁，并用紫外灯照射20min，进行空气的消毒灭菌。
细胞工程教案
细胞工程教案教案标题：细胞工程教案教案目标：1. 了解细胞工程的概念和背景知识；2. 掌握细胞工程的基本原理和技术；3. 实施细胞工程实验，并解释实验结果；4. 培养学生的实验操作能力和科学思维。
教案步骤：一、导入（5分钟）1. 向学生简单介绍细胞工程的定义和相关背景知识；2. 引导学生讨论和思考细胞工程的应用领域。
二、知识讲解（15分钟）1. 详细讲解细胞工程的基本原理和技术，包括细胞培养、基因编辑和细胞重编程等；2. 给予学生示意图和实例，让他们更好地理解相关概念。
三、实验演示（20分钟）1. 展示一个简单的细胞工程实验，如基因转染；2. 详细解释实验过程和步骤；3. 强调安全操作和实验室规范。
四、实验操作（30分钟）1. 学生分组进行实验操作；2. 指导学生正确使用实验仪器和试剂；3. 督促学生记录实验过程和结果。
五、结果解释和讨论（15分钟）1. 学生根据实验结果，进行数据分析和解释；2. 引导学生深入思考实验结果的意义和可能的应用。
六、扩展活动（15分钟）1. 引导学生展开与细胞工程相关的研究性课题或小组讨论；2. 鼓励学生提出自己的观点和创新想法。
七、总结（5分钟）1. 让学生总结今天学到的关于细胞工程的知识；2. 解答学生的问题，并强调细胞工程的潜在应用和意义。
教案评估：1. 老师观察学生在实验操作过程中的技能和实验室的安全意识；2. 检查学生对细胞工程相关知识的理解和应用。
教案备注：1. 教师应提前准备好实验所需的材料和设备，并确保实验室的安全性；2. 鼓励学生积极参与实验操作和讨论，并引导他们思考细胞工程在当前和未来的应用前景；3. 注意实验操作过程中的实验室安全规范和个人卫生习惯。
《细胞工程》实验指导书
实验指导书课程：细胞工程授课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。
二、材料与用具：1、药品：生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。
2、用具：分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。
三、教学时数：4课时。
四、实验内容：（一）实验室的基本结构及主要设备：1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。
2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。
3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：存放试剂及器皿。
4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。
5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。
6、培养室：培养架、摇床等功能：培养物的控制培养。
7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。
（二）培养基母液的配制：1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L2、激素类母液的配制：①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。
注：精度要求精确到小数点后三位。
（三）培养器皿的洗涤：1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理；2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。
细胞工程实验指导
细胞工程实验指导
细胞工程实验是一种研究细胞的实验，它可以帮助我们了解细胞的结构和功能，以及它们如何在细胞内运作。
细胞工程实验可以帮助我们更好地理解细胞的生物学过程，从而更好地治疗疾病。
细胞工程实验的步骤包括：
1.准备实验：准备实验所需的设备和材料，如细胞培养基、细胞培养器、细胞染色剂等。
2.细胞培养：将细胞放入细胞培养器中，添加细胞培养基，控制温度和湿度，使细胞可以
正常生长。
3.细胞染色：使用细胞染色剂，染色细胞，以便更好地观察细胞的结构和功能。
4.细胞分析：使用显微镜观察细胞，分析细胞的结构和功能，以及它们如何在细胞内运作。
5.细胞操作：使用基因工程技术，改变细胞的基因组，以改变细胞的功能。
细胞工程实验是一种重要的研究工具，它可以帮助我们更好地理解细胞的生物学过程，从而更好地治疗疾病。
因此，细胞工程实验的指导是非常重要的，以确保实验的准确性和可靠性。
动物细胞工程实验指导
实验时间实验内容4月11日实验一培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二细胞的传代培养4月25日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401实验四染色体制备（6-10组）3015月2日实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401实验四染色体制备（1-5组）3015月9日实验五细胞的复苏与冻存实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1.掌握常见培养用液的配制方法。
2.掌握常用的灭菌方法。
3.了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
植物细胞工程实验 (修改版)
植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。
三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。
四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。
动物细胞工程试验讲义(学生版)
实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。
即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。
无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。
任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。
1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。
2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。
消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。
通常用化学方法来达到消毒的作用。
灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。
应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。
能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。
对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。
在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。
灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。
灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。
可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。
3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。
实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。
主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。
4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。
细胞工程实验
二、实验原理
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并 不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触 抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染色体， 分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养 的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。
不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置 于培养箱中不予理睬。
较为标准的实验操作
将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰
新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
将小白鼠置超净工作台 上，打开腹腔
1.用0.25%胰酶液消化 2.终止消化，吹散细胞 3.细胞传代 4.置于37℃下培养
细胞传代的几种方法
3、离心，设置离心机1000转/分，1-2分钟， 沉淀即可。 4、取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液 缸。吸取培养液约7mL放入离心管，轻轻吹 打细胞，使之均匀悬浮后转至另外3小平皿中 待分装，注意不要污染！ 三、细胞的冻存和复苏 详细操作见实验指导。
虽然实验失败了，没有得到预期结果， 但是不可否认的是实验整个操作过程我们都 认真参与了，每个知识点和各种方法都掌握 了，以后遇到相关类容就更熟悉。这也算是 一种收获吧。
二、离心法进行传代
1、从培养箱内取出培养的小鼠肾脏细胞，每 组一瓶。放在显微镜下观察其生长状态、密 度。 生长状态检测：台盼蓝法。 2、观察培养瓶孔中培养液量。用吸管分别吸 出瓶中的细胞连同培养液，转入15ml塑料离 心管中。再用另一支吸管吸取PBS量约2ml， 加入培养瓶中，轻轻吹打瓶壁，吸出转入离 心管中，大约总量为10ml左右。
细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置 移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的 微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成 分通过食入或吸入的方式及入人体，可能对 研究人员造成伤害。 细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶 超下放置与工作台中。
植物细胞工程实验教案设计与实施
植物细胞工程实验教案设计与实施植物细胞工程是一门以植物细胞为基础，综合运用生物学、细胞学、生物化学等学科的技术与理论，通过扩增、变异、转导等手段对植物细胞进行改良和转化的学科。
在现代生物技术的发展中，植物细胞工程技术是一项非常重要的技术。
植物细胞工程实验教案的设计与实施，是提高学生实验技能、培养创新思维和实践动手能力的重要手段，可以让学生在实验中探索科学的奥秘和实践操作的方法。
下面，我们就从植物细胞工程实验教案的设计、实施和教学效果等方面进行详细探讨。
一、实验教案设计1.实验目的要给学生设计一个明确的实验目的，让学生在实验中穿针引线，探索实验的本质。
比如，通过本实验，让学生了解植物细胞培养的基本过程，掌握细胞培养的操作技术及注意事项；了解外源DNA的转化过程及其作用机制；理解基因工程的原理和应用等。
2.实验材料实验用品包括细菌、质粒、细胞水平、植物组织、培养基等。
在实验材料的选择上，要考虑其来源、质量、保存时间等因素，以保证实验的成功率和结果的可靠性。
3.实验操作流程实验操作流程是实验制定的重要环节之一，它要包括实验的步骤、时间、温度、药品用量、培养条件等关键信息。
为了使学生了解实验的具体步骤，可以将实验操作步骤分解，逐步展示其具体操作流程，让学生能够清楚地理解实验。
4.实验指导书实验指导书是学生开展实验的重要参考，可以帮助学生更好地理解实验的目的、操作流程、注意事项等，保证实验的准确性与稳定性。
在实验指导书的编写上，必须要按照实验操作步骤逐步介绍实验的主要流程，并详细阐明实验过程各项操作的注意事项及方法，以充分保证实验操作的正确性和安全性。
二、实验实施在实验实施中，时刻注意教学实验的效果和学生的实验技能，让学生在实验过程中更好地掌握实验技能和科学态度。
1. 实验前准备实验前务必做好各项准备工作，包括实验首席、实验器材、实验标志、实验材料等。
在实验器材准备上，要检查每件器材是否齐全、完好，标志是否正确并妥善保存。
细胞工程实验指导(2007级)
细胞工程实验实验一培养基母液的制备一、实验目的母液（stock solution）即以所设计的培养基中的化学成分进行单独或按几种相似成分配制成扩大一定倍数呈物理性质状态变化的溶液。
制备母液的目的不仅减少配制培养基时反复称量的重复工作量问题，而且更重要的是保证了试验的重复性和试验的精确性。
通过实验，了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类，掌握培养基母液配制的一般原理与基本方法。
二、实验原理不论什么种类的培养基，其中的基本成分都包括大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、植物激素等几类物质。
在配制培养基之前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常常将配制培养基所需成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱内保存。
当配制培养基时，按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。
三、实验器具电热干燥箱、冰箱、天平、水纯化装置、电热搅拌器、微波炉或电炉；棕、白色试剂瓶（100ml、500 ml、1000 ml）、玻棒、烧杯（100 ml、250 ml）、容量瓶（50 ml、250 ml、500 ml、1000 ml）。
四、实验方法为简化一种培养基的配制工作，一般分别将用量大的、用量甚微的无机盐类归类配制成混合母液，其他有机物类是按照单个母液进行配制的；但在研究不同培养基的配制时，往往是无论什么种类的培养基，其中所含的化学成分大体上是相似的，若每个成分均按单个配制成母液，则完全可以方便地实现多种培养基配方的研究。
现以MS基本培养基（Murashige和Skoog,1962）为实例，介绍混合母液与单个母液的配制方法。
1、大量元素母液的配法大量元素的用量大，混合母液按培养基配方的需要量，配制倍数不宜过大，一般扩大10倍即可；单个母液则按扩大20倍配制。
方法按表 1-1MS配方中大量元素序号，将各种化合物的称量分别扩大后用天平称取，并分别用适量蒸馏水溶解于250ml烧杯中（如溶解速度慢，可稍加热），再定容至所配制的母液体积；混合母液则依次混合已熔化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，最后定容至所配制的母液体积。
细胞工程基础实验技术(细胞育种)教案
实验1 细胞工程基础实验技术实验准备：MS培养基母液配制按配方表配制MS培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于2～4℃的冰箱中。
植物激素配制BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。
1.1 实验目的使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。
1.2 实验用品及溶液实验按每4个学生一组，每组分发培养基母液及激素母液一套，50ml量筒、1000ml 有刻度烧杯、吸球、电炉各1 个，5ml移液管9支，50ml三角瓶20个。
公用设备：pH计，高压灭菌锅。
1.3 操作方法实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。
愈伤组织诱导培养基：MS＋BA 2mgl-1+NAA mgl-1+ Sucrose 20g-1+ Agar 7g-1 A．向容量瓶中顺序加入培养基母液：大量元素25ml微量元素2.5ml铁盐 2.5ml其它成分各2.5mlBA和NAA 各2.0mlB．加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。
C．加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。
用记号笔写上学号或姓名。
D. 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min.左右。
灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。
1.4 记载内容培养基配制过程。
灭菌方法介绍不同类型灭菌设备的使用方法；采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。
实验2 无菌操作及愈伤组织诱导技术实验准备：烟草无菌试管苗培养：将烟草种子用消毒液84＃消毒后，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在MS培养基上。
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实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。
晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。
旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒1．物理消毒法(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。
这是常使用的消毒方法之一。
(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。
将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。
用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8 h。
(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。
主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
手动高压灭菌锅操作如下：①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。
②加热高压锅。
将放气阀打开，放气5—10 min，以排除锅内的冷空气。
③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。
调节火力大小保持该压力。
④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。
电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)：①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。
②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1／3－2／3处。
③打开电源。
④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105－121℃，高压灭菌一般采用121℃20—30 min。
⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。
⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。
⑦按start钮，开始高压，在温度达80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。
当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。
温度降至80℃时，蜂鸣器报警10次。
显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。
⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。
(4)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。
采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。
滤器型号按直径大小划分。
如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。
过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。
滤膜孔径有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0．22μm。
②用布包好，湿热灭菌后使用。
2．化学消毒法常用的消毒液有如下几种：(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。
超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。
使用浓度请按瓶上说明。
(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。
用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。
将门窗紧闭1—3 d。
可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。
将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。
用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。
1—3 d 后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事项1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。
因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。
当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。
器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
．3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。
压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。
空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
六、思考题1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?II、传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二、实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。
所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9．9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
2、试剂L磷酸盐缓冲液(PBs)无钙、镁溶液细胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺o．5％台盘蓝染液等3、材料喉癌细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1.营养液配制:EMEM液90%犊牛血清 10%双抗(1万单位／m1) 加至约100单位／m13％谷氛酞胺1m17．4％NaHCO3调pH至6．8—7．02．换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。
3.消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。