高效液相色谱法

高效液相色谱法

1 HPLC测定条件

色谱柱:ODS-2 HYPERSIL (250mmX4.6mm, 5um)不锈钢柱

流动相:乙睛:KH2P04溶液(0.05mo1/L}(16:84, V/V}

检测器:紫外吸收检测器

检测波长:355nm

柱温:25℃

流速:1 mL/min

紫外检测器灵敏度:0.020 AUFS

进样量:20uL.

2标准曲线及线性范围

用流动相将土霉素贮备液分别稀释成80mg/L , 40mg/L , 20mg/L , 10mg/L ,5mg/L等几个浓度。用高效液相色谱仪检测各稀释样品。每次进样量为20uL(进

样阀定量)，每次处理重复5次。取峰面积的平均值作标准曲线，并求得回归方程。

3样品处理

取配制好的无机盐培养基2mL，加入6mL Mcllvaine缓冲液，然后分别加入

1mL正己烷，1mL三氯甲烷，涡旋混合2min，超声30s使均质，4500r/min离心

10min，上清液经0.45 um水系微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

4回收率的测定

加入一定浓度的土霉素标准工作液于空白无机盐培养基中，制得土霉素浓度

为1, 10 , 50mg/L，旋涡混匀，经2.2.3项下的方法处理后，取上清滤液20uL进行

HPLC分析。同时按土霉素的加入量计算上清滤液中土霉素的实际浓度(土霉素实

际浓度为0.25, 2.5和12.5mg/L，再取一定量的土霉素标准贮备液用流动相配成对

应的标准工作液浓度(土霉素浓度为0.25, 2.5和12.5mg/L，进样20uL作HPLC分

析，用下面公式计算各浓度的添加回收率。每一浓度做5次重复。回收率的计算公

式为:

回收率一二x 100%

AS

注:式中A为无机盐培养基中土霉素的峰面积，As为相应标准工作液中土霉素

的峰面积。

5精密度的测定

加入一定浓度的土霉素标准混合工作液于空白无机盐培养基中，制得培养基

中土霉素浓度为1, 10, 50mg/L，经2.2.3项下的方法处理后，取上清滤液20uL

进行HPLC分析，每批次(同日内)各浓度的样品重复测定5次，得出土霉素的

峰面积，用标准曲线回归方程计算培养基药物浓度，求出日内变异系数。在一周

内共进行5个批次测定，根据土霉素的峰面积，用标准曲线回归方程分别计算出

培养基药物浓度，求出日间变异系数。

6定量方法

数据处理系统可以自动计算峰面积，根据添加到无机盐培养基中的药物对照

品的浓度与峰面积作出标准曲线，将每个待测样品的峰面积代入标准曲线，可算

出各自的浓度。

将样品峰的保留时间与对照品的保留时间比较，确定样品中土霉素保留时间与出峰位置，对样品中土霉素定性。