真核细胞的基因转染技术

DNA与脂质体的比例 对于大多数阳离子脂质体试剂，应优 化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得 到最大的转染效率。 尽管大多数脂质体试剂说明书都推荐 了比例，但每个实验得到的ＤＮＡ的质 量,不同的细胞以及相同的细胞不同的生 长状态可能得到的结果都会有差异．

有血清时的转染 因为血清会影响复合物的形成 ，所以在 DNA-阳离子脂质体复合物形成时应不含血清 ， 在转染过程中是可以使用血清的 ，但阳离子脂 质体和DNA的最佳量在使用血清时需要进行优 化． 最好用不含血清的培养基转染，在转染２－ ５小时后，再换用含血清的培养基．
如何将核酸转导至真核细胞？

转染：通过生化或者物理方法将目的基 因导入真核细胞中。 感染：通过病毒介导，用基因组中携带 有克隆目的片段的病毒来感染靶 细胞。

病毒介导法

通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相 互作用而进入宿主细胞,之后反转录酶启动合成 DNA并随机整合到宿主基因组中。

以病毒为基础的基因载体,是对其病毒基因组进 行操作和改造，使它携带外源基因和相关基因 元件，并被包装成病毒颗粒。携带外源基因的 病毒载体被包装成病毒颗粒就构成了基因导入 系统 。
实验目的
实验利用能表达绿色荧光蛋白的真核表达载 体pEGFP-n1, 在阳离子脂质体介导下,转染到肿 瘤细胞系Hela细胞中，并用荧光显微镜观察 GFP在细胞中的表达情况。
掌握基因导入真核细胞的常用的方法.
阳离子脂质体试剂
瞬时和稳定表达

瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基 因的表达 ．DNA转染后，转入基因的表 达可以在1－4天内检测到 ．几天内，大 部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞 分裂而稀释；一周后就检测不到其存在 了

稳定转染细胞系的筛选
要进行稳定的表达分析，在转染后４８小时 低密度传代铺板(一般按1：8-10传代)，给予生 长空间，加入抗生素，在几天或数周内保持筛 选压力，杀死未转染细胞，转染的细胞呈现克 隆性生长。
成功的基因转染取决于

质粒DNA的质量 必须无蛋白质，无RNA和其它化学物 质的污染，无毒素，OD260/280比值应在 1.8以上 经典的CsCl梯度离心，以及转染级的 质粒DNA纯化试剂盒得到的ＤＮＡ都比 较可靠．

阳离子脂质体试剂 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形 成复合物, 然后脂质体上剩余的电核与细胞膜 上的唾液酸残基的负电核结合; 另一种解释是 通过细胞是内吞作用而被进入细胞。
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特点 可用于稳定转染、瞬时转染几乎可以适用于 所有细胞，使用方法简单, 可携带大片段DNA, 通用于各种类型的裸露DNA或RNA, 能转染各 种类型的细胞, 没有免疫原性。
物理方法



基因枪粒子轰击法 将DNA用显微重金属 颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入 细胞, DNA在胞内逐步释放, 表达。 显微注射法 用显微操作将DNA直接注入 靶细胞核。转染细胞数有限, 多用于工程改造 或转基因动物的胚胎细胞。 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位, DNA通过膜上形成的小孔导入。 转染大的基 因（>65kb）。
真核细胞的基因转染技术
郝好杰
基因转染的定义
将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核 酸在细胞内维持其生物功能。其中，核酸包括DNA， 反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。 基因转染技术被广泛应用于基因组功能研究（基 因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究） 和基因治疗研究。

细胞铺板密度 用于转染的最佳细胞密度根据不同的细 胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁 细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为 2×106-4×106细胞/ml时效果较好，确保 细胞在对数增长期．最好在细胞未长满 时转代，并在第二天用于转染．

培养基中的抗生素 阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使 抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性， 导致转染效率低 ．所以，在转染培养基中不能 使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板 时也要避免使用抗生素。 对于稳定转染，不要在选择性培养基中使 用青霉素和链霉素
生化方法


DEAE－葡聚糖法 正电DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细 胞内吞 。 可以转染的细胞系有限 磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜 被细胞内吞。 阳离子聚合物法 带正电的聚合物与核酸带 负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞 表面带负电的蛋白多糖相互作用, 并通过内吞 作用进入细胞。