植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建

ShiYan YanJiu
植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建
王 雪，尚晓敏，李桂玲,刘 琼*
吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052
摘 要：乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性，本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子，采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA 基因启动子连接到gusA基因上游，获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中，Western Blot定性测定的gusA表达情况，同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性，为利用该启动子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。

关键词：嗜酸乳杆菌；启动子；组成型表达载体；
Construction of constitutive Expression Vector Base on SlpA Gene
Promoter and the Function Analysis
Wang Xue, Shang Xiao-min，Li Gui-ling，Liu Qiong*
College of Food Engineering Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin, 130052
Abstract: Lactobacillus hosts have a high selectivity for the promoter of the expression vector. In this study, the promoter of the SlpA gene from Lactobacillus acidophilus was amplified by PCR, and the expression vector pSIP409 was used as the base frame to remove its inducible promoter. The promoter of the SlpA gene was ligated upstream of thegusAgene by Seamless Assembly Cloning technology and the recombinant plasmid 409SlpA was transformed into Lactobacillus plantarumNC8 by electrotransformation. The positive colony was screened by MRS-X-gluC medium and the specific colony was screened, and the complex steps of detecting the activity of expressed proteins were avoided. This study lays the foundation for further application of SlpA gene constitutive promoter. Keywords: Lactobacillus acidophilus; promoter; constitutive expression vector
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群革兰氏阳性、能够发酵碳水化合物、以乳酸为主要代谢产物的各类细菌统称，是人与大多数动物肠道内常见优势菌群。

由于乳酸菌在医药、食品、饲料生产等相关领域具有较高的应用价值，被公认为安全级微生物(generally recognized as safe，GRAS)[1]。

构建乳酸菌工程菌株最重要的是高效稳定表达，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传组件[2]，且乳酸菌属的启动子对宿主有着高度的选择[3]。

因此，在LAB表达系统中很少使用外源启动子。

目前可用于构建LAB表达载体的启动子主要有lac A、lac R、lacS、nisA/nisZ、nisF和usp等[4]，启动子数量偏少，并且大多数属于诱导型启动子[5]。

组成型乳酸菌表达载体在不添加诱导物情况下可以不断地表达目的蛋白，在饲料生产、食品
基金项目：吉林省教育厅科技研究项目（2016120）；
吉林工程技术师范学院（2016）校科研发展基金项目。

作者简介：王 雪（1995-），女，本科，生物工程专业，河北省阜城，E-mail:7107172322@.
*通讯作者：刘 琼（1980-）,女,实验师，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学。

E-mail:liuqiong@.
ShiYan YanJiu
发酵、疫苗开发等生产中简化操作步骤，同时降低成本，便于大规模生产。

嗜酸乳杆菌S-层蛋白是由SlpA 基因编码，是菌体含量最丰富的细胞蛋白质之一，占总蛋白质的10%～20%，研究证实认为S-层蛋白的启动子是强启动子，是细菌中最强启动子之一的乳酸脱氢酶基因启动子的两倍
[6]。

因此，利用便于检测的β-葡萄
糖醛酸酶（gusA）作为报告基因，以诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSSIP409为基础框架，利用编码嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因的启动子构建高效组成型表达载体，对拓宽LAB 的应用范围具有重要意义。

1 材料
1.1 菌株及质粒载体
嗜酸乳杆菌ATCC4356，植物乳杆菌NC8，大肠杆菌T OP 10，植物乳杆菌诱导型表达载体pSSIP409由吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存。

1.2 主要试剂
Pureplasmid Mini Kit、Bacteria Geno-mic DNA Kit、Gel Extraction Kit 购自康为世纪生物科技有限公司；DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、Bgl Ⅱ、Nco Ⅰ购自Ta-KaRa 宝生物；红霉素（20 mg/mL ）购自宜昌翔荣化工有限公司；5溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-gluc）购自北京驰名瑞生物科技有限公司；兔源gusA 抗血清购自北京生命科学研究所；HRP 标记羊抗兔IgG 购自康为世纪生物科技有限公司；Seamless Assembly Cloning Kit 购自中美泰和生物技术（北京）有限公司。

2 方法
2.1 目的基因的扩增
取37 ℃静置过夜培养的嗜酸乳杆菌按照Bacteria Genomic DNA Kit 说明书提取嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组。

以基因组为模板，根据Genbank 上发表的SlpA 基因启动子序列设计含有同源碱基序列的长引物(5’GTTTTTATATTACA GCTCCAGATCTACCGGTTGCTTGTGG3’)和SlpA YR （5’GGGGTTTCTACAGGACGTACCATGGATGCGTTAATA GTAG 3’)扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，下划线标注的是同源序列。

在100 µL
PCR 反应管中建立如下反应体系：嗜酸乳杆菌基因组1 µL，2×prime star max 50 µL，上、下游引物各2 µL，加灭菌水至100 µL。

反应条件： 98 ℃条件下变性10 s，45 ℃条件下退火5 s，72 ℃条件下延伸8 s，30个循环，最后一个循环72 ℃延伸1 min。

PCR 产物经0.8%琼脂凝胶电泳后观察结果，并对PCR 产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。

2.2 组成型表达载体构建与鉴定
将SlpA 基因启动子序列经凝胶回收纯化后，采用Seamless Assembly Cloning Kit 无缝克隆连接到经Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切的含有gusA 报告基因表达载体pSIP409上，CaCl 2化学转化法转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中。

用含红霉素的（200 µg/mL）的LB 固体培养基筛选阳性克隆。

挑取单克隆37 ℃过夜培养并抽提质粒获得含有报告基因的表达载体载体409SlpA，并进行限制性内切酶酶切鉴定及测序鉴定。

2.3 表达gusA 植物乳杆菌构建
将表达载体409SlpA 电转化到植物乳杆菌NC8中，用含有红霉素（200 µg/mL）和X-gluC （20 µg/mL）的MRS 固体培养基，37 ℃厌氧培养36 h 显色反应，同时选用不添加X-gluC 的MRS 固体培养基设定阴性对照，获得阳性重组植物乳杆菌L P_409S lp AG us A，挑取单克隆接种于5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中37 ℃厌氧过夜培养，质粒小量制备，酶切鉴定。

2.4 Western Blot 测定重组植物乳杆菌gusA 的表达
情况
挑取重组植物乳杆菌LP_409SlpAGusA 单克隆接种于含有5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS 培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，Western Blot 一抗使用兔抗gusA 血清室温孵育2 h，二抗使用HRP 标记羊抗兔IgG 室温孵育1 h，TBST 洗膜三次后显色。

3 结果
3.1 目的基因扩增
以嗜酸乳酸杆菌的染色体DNA 为模板，用引物SlpA YF 和SlpA YR 进行PCR 扩增S-层蛋白
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基因的启动子SlpA，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，结果表明PCR成功扩增出含有同源碱基序列的SlpA基因。

3.2 重组载体构建
通过无缝克隆试剂盒将删除启动子含有报告基因的载体与启动子连接后转化到大肠杆菌感受态Top10后获得重组表达载体409SlpA，质粒小量制备，测序结果通过NCBI Blast分析比较同源性100%。

结果表明，成功将SlpA基因启动子连接到目的载体上，测序结果经NCBI网站blast对比分析后同源性100%。

3.3 重组植物乳杆菌409SlpAGusA的显色反应
将表达载体409SlpAGusA电转化入植物乳杆菌NC8感受态中，涂布于添加显色底物X-gluC 和红霉素的MRS固体显色培养基，植物乳杆菌409SlpAGusA菌落有明显蓝色显色反应，结果表明SlpA启动子在植物乳杆菌中具有启动外源基因表达的功能，表达的β-葡萄糖醛酸酶具有与底物X-gluC发生显色反应生物学功能，同时获得了组成型表达载体409SlpAGusA。

3.4 Western Blot 检测植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA 表达gusA情况
通过Western Blot 分析，可见重组植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA表达出与预期大小相符的目的条带（≈67 kDa）。

4 讨论
目前基因工程乳酸菌领域采用的报告基因主要有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、荧光素酶基因（lux）和gusA等。

其中cat基因和lux的表达产物分析成本较高，而在乳酸菌中lacZ的背景表达量比较高，对启动子活性分析造成一定的干扰[2]。

gusA是一种酸性水解酶，在大肠杆菌中特异地存在，能水解多种可溶的β-葡萄糖醛酸衍生物，如X-gluC，起初gusA的检出用于大肠杆菌的判断，该法特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，可以用于大肠杆菌的快速定性和定量检测[7]。

而乳酸菌在可检测的范围之内都没有检测到β葡萄糖醛酸酶活性[8]。

因此，本研究中选gusA基因作为筛选乳酸菌组成型启动子的报告基因，将嗜酸乳杆菌表面蛋白基因的启动子SlpA连接到gusA基因上游，构建组成型表达载体。

传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR 产物经过双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。

这两种方法费时费力，过程繁冗。

本研究采用无缝克隆技术，突破传统的酶切再连接方法，在扩增SlpA启动子基因的上、下游引物上添加了同源碱基序列，用一步重组法，将目的基因连接到线性化的载体上，得到高效率克隆的重组载体，提高工作效率。

近年来，关于基因工程乳酸菌的发酵技术和疫苗研发等方面发展迅速，作为新型表达系统多种外源基因成功表达，由于其本安全、无毒，能提高机体免疫力等功能，作为表达和递呈外源蛋白的活载体[9]，具有比大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程受体菌更明显的优势[10～12]。

乳酸菌表达载体常用的启动子多为诱导型启动子，虽然表达效率比组成型启动子高，但是大规模发酵生产操作繁琐，成本高，所以从乳酸菌的特点和用途方面考虑，有待开发出一种组成型食品级表达载体/受体系统。

本研究以含有gusA报告基因的pSIP409为基本框架，将诱导型启动子组件切除，利用无缝克隆技术将嗜酸乳杆菌S层蛋白SlpA基因的启动子序列与其连接，构建组成型表达载体，并验证其启动子活性，拓宽乳酸菌表达载体的应用范围；研究证实嗜酸乳杆菌S-层蛋白启动子下游含有信号肽序列，同时此蛋白也具有在菌体表面锚定的功能，本研究成果为利用此组成型启动子构建组成型分泌表达或锚定表达载体奠定基础。

参考文献：
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[3] 张金宝，乌云塔娜．乳酸菌食品级高效表达载体系
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因应引起重视。

因此，在治疗由沙雷菌引起的奶牛乳房炎时，应尽量通过药敏试验筛选药物进行治疗，如果条件不具备，也应尽量避免使用耐药率高的一代头孢菌素和二代头孢菌素，可选择耐药率低的氨基糖苷类、喹诺酮类及碳青霉烯类药物。

参考文献：
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[6] 虞军雷,应华永,徐瑞龙.2010～2012年粘质沙雷 菌耐药性变迁[J].现代实用医学，2014,26（06）： 752～754. 吉
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牧主管部门登记备案。

6.2 防疫技术人员应具备中专以上畜牧兽医等相关专业学历教育。

蜂场工作人员至少每年进行一次健康检查。

传染病患者不应从事蜜蜂饲养和蜂产品生产工作。

6.3 禁止从疫区引进生产用种王、种群或输送卵虫养王。

6.4 蜂群用药应符合 NY 5030 的规定。

6.5 蜂场环境的卫生消毒和养蜂机具的卫生消毒应按 NY/T 5139 要求执行。

6.6 运载工具在装运前进行清扫、消毒、清洗，消毒方法应按 NY/T 5139 要求执行。

7　记录与档案
7.1 应建立养殖档案及养蜂日志。

7.2 及时记录蜂群的品种、数量、来源，检疫、消毒情况，饲料、兽药等投入品来源、名称，使用对象、时间和剂量，蜂群发病、死亡、无害化处理情况，蜂产品生产销售情况。

7.3 养殖档案及各种记录保存2年。

吉
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吉。