植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建

ShiYan YanJiu植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建王 雪，尚晓敏，李桂玲,刘 琼*吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052摘 要：乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性，本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子，采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA 基因启动子连接到gusA基因上游，获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中，Western Blot定性测定的gusA表达情况，同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性，为利用该启动子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。

关键词：嗜酸乳杆菌；启动子；组成型表达载体；Construction of constitutive Expression Vector Base on SlpA GenePromoter and the Function AnalysisWang Xue, Shang Xiao-min，Li Gui-ling，Liu Qiong*College of Food Engineering Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin, 130052Abstract: Lactobacillus hosts have a high selectivity for the promoter of the expression vector. In this study, the promoter of the SlpA gene from Lactobacillus acidophilus was amplified by PCR, and the expression vector pSIP409 was used as the base frame to remove its inducible promoter. The promoter of the SlpA gene was ligated upstream of thegusAgene by Seamless Assembly Cloning technology and the recombinant plasmid 409SlpA was transformed into Lactobacillus plantarumNC8 by electrotransformation. The positive colony was screened by MRS-X-gluC medium and the specific colony was screened, and the complex steps of detecting the activity of expressed proteins were avoided. This study lays the foundation for further application of SlpA gene constitutive promoter. Keywords: Lactobacillus acidophilus; promoter; constitutive expression vector乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群革兰氏阳性、能够发酵碳水化合物、以乳酸为主要代谢产物的各类细菌统称，是人与大多数动物肠道内常见优势菌群。

由于乳酸菌在医药、食品、饲料生产等相关领域具有较高的应用价值，被公认为安全级微生物(generally recognized as safe，GRAS)[1]。

构建乳酸菌工程菌株最重要的是高效稳定表达，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传组件[2]，且乳酸菌属的启动子对宿主有着高度的选择[3]。

因此，在LAB表达系统中很少使用外源启动子。

目前可用于构建LAB表达载体的启动子主要有lac A、lac R、lacS、nisA/nisZ、nisF和usp等[4]，启动子数量偏少，并且大多数属于诱导型启动子[5]。

组成型乳酸菌表达载体在不添加诱导物情况下可以不断地表达目的蛋白，在饲料生产、食品基金项目：吉林省教育厅科技研究项目（2016120）；吉林工程技术师范学院（2016）校科研发展基金项目。

作者简介：王 雪（1995-），女，本科，生物工程专业，河北省阜城，E-mail:7107172322@.*通讯作者：刘 琼（1980-）,女,实验师，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学。

E-mail:liuqiong@.ShiYan YanJiu发酵、疫苗开发等生产中简化操作步骤，同时降低成本，便于大规模生产。

嗜酸乳杆菌S-层蛋白是由SlpA 基因编码，是菌体含量最丰富的细胞蛋白质之一，占总蛋白质的10%～20%，研究证实认为S-层蛋白的启动子是强启动子，是细菌中最强启动子之一的乳酸脱氢酶基因启动子的两倍[6]。

因此，利用便于检测的β-葡萄糖醛酸酶（gusA）作为报告基因，以诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSSIP409为基础框架，利用编码嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因的启动子构建高效组成型表达载体，对拓宽LAB 的应用范围具有重要意义。

1 材料1.1 菌株及质粒载体嗜酸乳杆菌ATCC4356，植物乳杆菌NC8，大肠杆菌T OP 10，植物乳杆菌诱导型表达载体pSSIP409由吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存。

1.2 主要试剂Pureplasmid Mini Kit、Bacteria Geno-mic DNA Kit、Gel Extraction Kit 购自康为世纪生物科技有限公司；DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、Bgl Ⅱ、Nco Ⅰ购自Ta-KaRa 宝生物；红霉素（20 mg/mL ）购自宜昌翔荣化工有限公司；5溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-gluc）购自北京驰名瑞生物科技有限公司；兔源gusA 抗血清购自北京生命科学研究所；HRP 标记羊抗兔IgG 购自康为世纪生物科技有限公司；Seamless Assembly Cloning Kit 购自中美泰和生物技术（北京）有限公司。

2 方法2.1 目的基因的扩增取37 ℃静置过夜培养的嗜酸乳杆菌按照Bacteria Genomic DNA Kit 说明书提取嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组。

以基因组为模板，根据Genbank 上发表的SlpA 基因启动子序列设计含有同源碱基序列的长引物(5’GTTTTTATATTACA GCTCCAGATCTACCGGTTGCTTGTGG3’)和SlpA YR （5’GGGGTTTCTACAGGACGTACCATGGATGCGTTAATA GTAG 3’)扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，下划线标注的是同源序列。

在100 µLPCR 反应管中建立如下反应体系：嗜酸乳杆菌基因组1 µL，2×prime star max 50 µL，上、下游引物各2 µL，加灭菌水至100 µL。

反应条件： 98 ℃条件下变性10 s，45 ℃条件下退火5 s，72 ℃条件下延伸8 s，30个循环，最后一个循环72 ℃延伸1 min。

PCR 产物经0.8%琼脂凝胶电泳后观察结果，并对PCR 产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。

2.2 组成型表达载体构建与鉴定将SlpA 基因启动子序列经凝胶回收纯化后，采用Seamless Assembly Cloning Kit 无缝克隆连接到经Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切的含有gusA 报告基因表达载体pSIP409上，CaCl 2化学转化法转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中。

用含红霉素的（200 µg/mL）的LB 固体培养基筛选阳性克隆。

挑取单克隆37 ℃过夜培养并抽提质粒获得含有报告基因的表达载体载体409SlpA，并进行限制性内切酶酶切鉴定及测序鉴定。

2.3 表达gusA 植物乳杆菌构建将表达载体409SlpA 电转化到植物乳杆菌NC8中，用含有红霉素（200 µg/mL）和X-gluC （20 µg/mL）的MRS 固体培养基，37 ℃厌氧培养36 h 显色反应，同时选用不添加X-gluC 的MRS 固体培养基设定阴性对照，获得阳性重组植物乳杆菌L P_409S lp AG us A，挑取单克隆接种于5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中37 ℃厌氧过夜培养，质粒小量制备，酶切鉴定。

2.4 Western Blot 测定重组植物乳杆菌gusA 的表达情况挑取重组植物乳杆菌LP_409SlpAGusA 单克隆接种于含有5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS 培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，Western Blot 一抗使用兔抗gusA 血清室温孵育2 h，二抗使用HRP 标记羊抗兔IgG 室温孵育1 h，TBST 洗膜三次后显色。

3 结果3.1 目的基因扩增以嗜酸乳酸杆菌的染色体DNA 为模板，用引物SlpA YF 和SlpA YR 进行PCR 扩增S-层蛋白ShiYan YanJiu基因的启动子SlpA，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，结果表明PCR成功扩增出含有同源碱基序列的SlpA基因。

3.2 重组载体构建通过无缝克隆试剂盒将删除启动子含有报告基因的载体与启动子连接后转化到大肠杆菌感受态Top10后获得重组表达载体409SlpA，质粒小量制备，测序结果通过NCBI Blast分析比较同源性100%。

结果表明，成功将SlpA基因启动子连接到目的载体上，测序结果经NCBI网站blast对比分析后同源性100%。

3.3 重组植物乳杆菌409SlpAGusA的显色反应将表达载体409SlpAGusA电转化入植物乳杆菌NC8感受态中，涂布于添加显色底物X-gluC 和红霉素的MRS固体显色培养基，植物乳杆菌409SlpAGusA菌落有明显蓝色显色反应，结果表明SlpA启动子在植物乳杆菌中具有启动外源基因表达的功能，表达的β-葡萄糖醛酸酶具有与底物X-gluC发生显色反应生物学功能，同时获得了组成型表达载体409SlpAGusA。

3.4 Western Blot 检测植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA 表达gusA情况通过Western Blot 分析，可见重组植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA表达出与预期大小相符的目的条带（≈67 kDa）。