生物素-过氧化物酶
免疫组化sabc法原理
免疫组化sabc法原理免疫组化SABC法原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体和免疫反应来检测组织样本中特定蛋白质的方法。
免疫组化技术的发展为研究细胞和组织中蛋白质的表达和定位提供了一种有效的手段。
在免疫组化技术中，SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是一种常用的放大方法，用于增强目标抗原的检测信号。
SABC法的原理是通过将抗原特异性的一抗与生物素化的二抗结合，再利用亲和力很强的鸡蛋白素-链霉亲和素（Streptavidin-biotin）结合系统，将生物素与酶或荧光染料等标记物连接起来，从而使目标抗原能够被可视化。
具体而言，SABC法分为四个步骤：抗原修复、阻断、一抗孵育和二抗孵育。
首先是抗原修复，组织样本通常需要进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫活性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解和酸性处理等。
接下来是阻断步骤，目的是阻止非特异性结合。
通常使用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）、小鼠血清、马血清和羊血清等。
然后是一抗孵育，将具有特异性的一抗与待检测的抗原结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择取决于实验的需求。
最后是二抗孵育，将生物素化的二抗与一抗结合。
二抗通常是兔源抗小鼠IgG的抗体，也可以是其他动物源的抗体。
生物素化的二抗通过亲和力结合到一抗上，形成免疫复合物。
在SABC法中，生物素与酶或荧光染料等标记物结合，常用的酶标记有辣根过氧化物酶（HRP），荧光标记有荧光素酶（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。
这些标记物能够使抗原产生可见的颜色或荧光信号。
在目标抗原上添加底物，使酶催化底物产生可见的颜色反应，或者直接观察荧光信号。
通过显微镜观察或图像分析系统，可以定量分析目标抗原的表达和定位。
免疫组化SABC法具有高度特异性和敏感性，能够定量检测目标抗原在组织中的表达水平和定位。
它在研究细胞生物学、病理学和分子生物学等领域发挥了重要作用。
卵白素生物素过氧化物酶复合物法ABC法
卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）1. 原理：本方法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学特性，先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物。
具体步骤是：特异性抗体与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物。
生物素化二抗再与特异性抗体反应，然后加入ABC复合物，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物。
最后DAB显色。
2. 基本染色方法：（1）切片常规脱蜡至水。
（2）PBS洗5分钟×2次。
（3）0.3%甲醇-H2O2 30分钟，37℃。
（4）PBS洗5分钟×2次。
（5）正常动物血清20分钟，37℃。
（6）适当稀释的特异性抗体60分钟，37℃。
（7）PBS洗5分钟×2次。
（8）适当稀释的生物素标记二抗，30分钟，37℃。
（9）PBS洗5分钟×2次。
（10）ABC复合物30-60分钟，37℃。
（11）PBS洗5分钟×2次。
（12）DAB显色，镜下控制。
（13）苏木素衬染、脱水、透明、中性树胶封固。
附：微波-ABC法，具体操作如下：1. 常规脱蜡：二甲苯I、II各10分钟，无水酒精I、II 各10分钟。
2. 将切片置入装有PBS液的染色缸中，微波修复1分钟，冷却置室温。
3. 滴加第一抗体，微波修复1分钟，孵育20分钟，PBS 液冲洗3缸×3分钟。
4. 滴加第二抗体，微波修复1分钟，孵育10分钟，PBS 液冲洗3缸×3分钟。
5. 滴加第三抗体，微波修复1分钟，孵育10分钟，PBS 液冲洗3缸×3分钟。
6. DAB显色，（显微镜下控制）终止显色，蒸馏水水冲洗。
7. 苏木素衬染，盐酸酒精分化，水洗，封片。
直接法1. 原理：用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原-抗体反应的部位。
优点：简单、步骤少、省时、特异性强、非特异染色较轻。
07 生物素-亲和素
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。 亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
Ag+B· Ab Ag-Ab· B
亲合素(A)
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
底物
酶标生物素
生物素化的抗体
+A
+A
BA法（标记亲和素-生物素法）
生技常用缩写词
生技常用缩写词缩写全称中文AA autoantibody 自身抗体AAF aminoacetylfluorescence 氨乙酰基荧光Ab antibody 抗体ABC avidin-biotin peroxidase complex 抗生物素（亲合素）-生物素-过氧化物酶复合物ACh acetycholine 乙酰胆碱AChR acetycholine receptor 乙酰胆碱受体AChRAb acetycholine receptor antibody 乙酰胆碱受体抗体ACIF anti-complement immunofluorescent method 抗补体免疫荧光法α-1-ACt alpha(α)-1-anti-chymotrypsin α-1-抗糜蛋白酶ACTH adrenocorticotropin hormone 促肾上腺皮质激素AD Alzheimer’s disease 老年性痴呆ADDC antibody dependent cytotoxic cell 抗体依赖细胞毒细胞ADH antidiuretic hormone 抗利尿激素AEC 3-amino-9-ethyl-carbazole 3-氨-9-乙基咔唑AFP alpha(α)-fetal-protein 甲胎蛋白AHA anti-histone antibody 抗组蛋白抗体AKP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶ALP Alkaline Phosphatase 碱性磷酸酶AMA anti-mitochondrial antibody 抗线粒体抗体ANA anti-nuclear antibody 抗核抗体ANCA anti-neutrophil cytetoplasmic anti-autoantibody 抗中性粒细胞胞浆抗自身抗体APUD amine content and /or amine precursor uptake and de-carboxylation 含氨和/或氨前体并能脱羧的细胞AO Acrine Orange 吖啶橙ARs arsanilic acid 对氨苯砷酸α-1-AT alpha(α)-1-anti-trypsin α-1-抗胰蛋白酶BCDF B cell differetiation factor B细胞分化因子BCGF B cell growth protein B细胞生长因子BGP bone growth protein 骨生长蛋白BGP brain-gut peptides 脑肠肽BMP bone marphogenic protein 骨形成蛋白BMZ basement membrane zone 基底膜带BRAB bridged avidin-biotin technique 桥抗生物素-生物素技术BrdU 5-bromo-2-deoxyuridine 5-溴尿脱氧核苷BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白CA catecholamine 儿茶酚胺CAg cytoplasmic antigen 胞质抗原CAH chronic active hepatitis 慢性活性性肝炎CALLA common acute lymphocytic leukaemia antigen 普通急性淋巴细胞性白抗原cAMP cyclic guanosine monophosphate 环化-磷酸鸟苷CEA Carcinoma embryonicantigen 癌胚抗原CDI carbodiimide 碳二亚胺CGRP calcitonin gene-related peptide 降钙素基因相关肽CHAc choline acetylase 胆碱乙酰化酶ChE cholinesterase 乙酰胆碱酯酶CIg cytoplasmic immunoglobulin 胞浆免疫球蛋白CK cytokeratin 细胞角蛋白CLA common leukocyte antigen 白细胞共同抗原CMV cytomegalovirus 巨细胞病毒CNS central nervous system 中枢神经系统Con.A concanavalin A 刀豆素ACPK creation phosphokinase 肌酸磷酸激酶CPM counts per minute 每分钟计数cRNA complementary RNA 互补RNACRP c-reation protein C-反应蛋白CSF cerebrospinal fluid 脑脊液CT Cholera toxin 霍乱毒素CT-HRP cholera-toxin-horseradish peroxidase 霍乱毒素辣根过氧化物酶CUC Chronic ulcerous colonitis 慢性溃疡性结肠炎CVD cerebrovascular disease 脑血管病DA dopamine 多巴胺DAB diaminobezidin 二氨基联苯氨DBA Dolichos bifows agglutinin 双花扁豆凝集素DBH dopamine-β-hydroxylase 多巴胺-β羟化酶DEAE diethyl-amino-ethyl-dextran 二乙氨乙基葡聚糖DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯DDC dopamine decarboxylase 多巴胺脱羧酶Des desmine 结蛋白DIF direct immunofluorescent method 直接免疫荧光法Dig digoxigenin 地高辛DMDC dimethydichlorasilane 二甲基二氯硅烷DMF dimethyformamide 二甲基甲酰胺DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DNP dinitrophenyl aminopropionitrile imide ester 二硝基苯氨基丙氰亚酰氨酸酯DRC dendric reticulum cell 树突状网状细胞dsDNA double stranded DNA 双链DNADTT dithiothreitol 二硫苏糖醇DYN dynorphin 强啡肽EBV Epistein-Barr virus E-B病毒ECD-G1 1-ethyl-3(3-dimethy-aminopropyl)carbodiimide-HCL-Glutaldehyde 碳二亚酰胺-戊二醛ECM extracellular matrix 细胞外基质ED50 median effective dose 半数有效剂量EDTA ethylendiaminotetraacetic acid 乙二氨四乙酸EK epidermal keratin 表皮角蛋白ELISA enzyme-liked immunosorbent assay 酶联免疫吸附分析EM electron microscope 电镜ENK enkephalin 脑啡肽L-ENA(L-NK) Leu-enkephalin 亮氨酸-脑啡肽M-ENK(M-NK) met-enkephalin 甲硫氨酸-脑啡肽ENS enteric nervous system 肠神经系统β-EP β-endorphin β-内啡肽FA formaldehyde 甲醛Fab antigen-binding fragment 抗原结合片段FACs fluorescent actived cell sortor 荧光激活细胞计数器FAV flat agranular vesicle 扁平无颗粒囊泡FB fast blue 快蓝Fc crystallizable fragment 可结晶片段FCC follicular centre cell 滤泡中心细胞FCM flow cytometer 流式细胞计数仪FCP feature count point 特征计数点FDA fluorescin diacetate 二醋酸酯荧光素■［此处缺少一些内容］■FSH follicle-stimulating hormone 卵泡刺激素FTA fluorescent treponemal antibody 荧光梅素螺旋体抗体FTA-ABS fluorescent treponemal antibody absorption test 荧光梅毒螺旋体抗体吸收实验GAB gold-labelled antibody 金标抗体GABA gamma(γ)-amino-butyric acid γ-氨基丁酸GALT gut –associated lymphoid tissue 胃肠道相关淋巴组织GAR goat anti-rabbit serum 羊抗兔血清GCA gastrin cell antibody 胃泌素细胞抗体GFAP glial fibrillary acidic protein 胶质纤维酸性蛋白GFL green fluorescence 绿色荧光GH growth hormone 生素激素GLAD gold-labelled antigen detection method 金标抗原检测法GMA glycol methacrylate 乙二醇甲基丙烯酸酯GOD glucose oxidase 葡萄糖氧化酶GP gold particle 金颗粒HAV hepatitis A virus 甲型肝炎病毒HBV hepatitis B virus 乙型肝炎病毒HBV-DNA hepatitis B virus DNA 乙型肝炎病毒DNAHC Huntington’s chorea 亨廷顿氏舞蹈症HCG human chorionic gonadotropin 人绒毛膜促性腺激素HE hemotoxylin and eosin staining 苏木精-伊红染色HEMA 2-hydroxyethyl methacrylate 羟乙基甲基丙烯酸酯HGH human growth factor 人生长激素5-HIAA 5-hydroxyindoleacetic acid 5-羟吲哚乙酸HLA human leukocyte antigen 人类白细胞抗原HMA hepatocyte membrane antibody 肝细胞膜抗体HP horizontal plate 水平面HPL human placenta lactogen 人胎盘催乳素HPRI human placental ribonuclease inhibitor 人胎盘核糖核酸抑止剂HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶HSA human sreum albumin 人血清白蛋白5-HT 5-hydroxytryptamine(serotonin) 5-羟色氨HTLV human T-lymphocyte virus 人T-淋巴细胞病毒LCAb islet cell antibody 胰岛细胞抗体ICAM intercellular adhersion molecule 细胞间粘附因子ICC immunocytochemistry 免疫细胞学IDD insulin dependent diabetes 胰岛素依赖性糖尿病IDRC(IRC) interdigitate reticulum cell 指突状网状细胞IEL intraepithelial lymphocyte 上皮内淋巴细胞IF intermediate filament 中间丝Ig immunoglobulin 免疫球蛋白IGS immunogold staining 免疫金染色IGSS immunogold –silver staining 免疫金-银染色IHC immunohistochemistry 免疫组织化学IIF indirect immnnofluotesent method 间接免疫荧光法IRIA indirect radioimmunoassay 间接放射免疫分析LAB labelled avidin-biotin technique 标记抗生物素（亲合素）-生物素技术LBT Lupus Band Test 狼疮带实验LC Langerhan’s cell 朗格罕氏细胞LCA Lens culinaris agglutinin 扁豆凝集素LCR ligose chain reaction 连接链式反应LDH lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶LFA leukcyte function- associated antigen 白细胞功能相关抗原LGV large granular vesicle 有颗粒大囊泡LH luteinizing hormone 黄体生成素LHRH luteinizing hormone relasing hormone 黄体生成素释放激素LHRF luteinizing hormone relasing factor 黄体生成素释放因子β-LPH β-lipotropic hormone β-促脂素LPL lamina propria T lymphcyte 固有层T淋巴细胞LPO lactiperoxidase 乳过氧化物酶MAG myelin associated glycoprotein 髓鞘相关糖蛋白MG myasthenia gravis 重症肌无力β-MG β-microglobin β-微球蛋白MBP myelic basic protein 髓磷酯碱性蛋白MBPAb myelic basic protein antibody 髓磷酯碱性蛋白抗体McAB monoclonal antibody 单克隆抗体MF microfilament 微丝Mg myohemoglobin 肌红蛋白MHC man histocompatibility complex 人类组织相溶性复合物mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸MS multiple sclerosis 多发性硬化症MSH melanocyte stimulating hormone 黑色素细胞刺激素MsIg membrane superfacial immuno-globulin 膜表面免疫球蛋白NA noradrenalin 去甲肾上腺素NAChR nicotinic acetylcholine receptor 烟碱型乙酰胆碱受体NADH nicotinamide adenine dinucleotide diaphorase 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶NANC non-adrenergic-non-cholinergic 非肾上腺素能非胆碱能NE norepinephrine 去甲肾上腺素NF neurofilament 神经丝NK natural killer 自然杀伤细胞NNE non-neuronal enolase 非神经元性烯醇化酶NP neuropeptide 神经肽NPY neuropeptide Y 神经肽YNSE neuron-specific enolase 神经元特异性烯醇化酶NT neurotensin 神经降压肽OD optical density 光密度6-OHDA 6-hydroxydopamine 6-羟多巴胺ORF open reading frame 开放读框ORT optimum renaturation temperature 最适复性温度OT oxytocin 催产素PAG protein A-gold technique 蛋白A-金技术PAP perbxidase anti-peroxidase complex 过氧化物酶-抗氧化物酶复合物PB phosphate buffer 磷酸缓冲液PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液PCA gastric parietal cell antibody 胃壁细胞抗体PcAb polyclonal antibody 多克隆抗体PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应PD Parkinson’s disease 帕金森氏症（震颤麻痹）PEG polyethylene glycol 聚乙二醇PFA paraformaldehyde 多聚甲醛PG prostaglandin 前列腺素pH symbol for expression of hydrogenion cincentration 表示氢离子浓度的符号PHA phaseolus vulgaris agglutinin 菜豆凝集素PHA phytohemagglutinin 植物凝集素PHSA poly human serium antigen 多聚人血清蛋白pI propidium Iodide 磺化吡啶PLL poly-L-Lysine （左旋）多聚赖氨酸PLP paraformaldehyde-lysine peroxidase 多聚甲醛-赖氨酸-过磺酸盐混合固定剂PNA peanut agglutinin 花生凝集素POM proopiomelanocortin 前促黑激素PP placenta protein 胎盘蛋白PP pancreas polypeptide 胰多肽PR progesteron receptor 孕激素受体PSA Pisum sativum agglutinin 豌豆凝集素PSS progressive systemic sclerosis 进行性全身性硬化PVP polyvinypyrolidone 聚乙烯吡咯烷酮PB200 rhodamin B200 诺丹明B200RCA Ricinus communis agglutinin 蓖麻凝集素RFL red fluorescence 红色荧光RH reactive hyperplasia 反应性增生RIA Radioimmunoasay 放射免疫分析RIA-CPB RIA-competitive protein binding 放免-竞争性蛋白结合RANA rheumatoid anti-nuclea antigen 类风湿性关节炎抗核抗原RPGN rapid progressive nephritis 进行性肾小管肾炎RPM rolls per minute 每分钟转速RRA radioreceptoassay 放射受体分析RT-PCR reverse transiption-PCR 反转录-PCRRSA rabbit serum albumin 兔血清白蛋白R-Sc Reed-Sternberg’s cell 瑞-司氏细胞Z/R Reinheit Zahl 光密度比值SAV small agranular vesicle 无颗粒小泡SBA soybean agglutinin 大豆凝集素SC secretory component 分泌成份SCV small clear vesicle 清亮小泡SDS sodium decdecyl sulfate 十二烷基硫酸钠SGV samll granular vesicle 有颗粒小泡SIg secretory immunoglobulin 分泌型免疫球蛋白SIS skin immunosystem 皮肤免疫系统SJA Sophora japonica agglutinin 槐凝集素SLE systemic lupus erythematosus 全身性红斑狼疮SMA smooth muscle Ab 平滑肌抗体SN small nuclea 小核SMA smooth muscle antibody 平滑肌抗体S/N signal/noise(ratio) 信/噪（比）SOM somatostatin 生长抑素SP silver particle 银颗粒SP substance P P物质SPA staphylococal protein A 金黄色葡萄球菌蛋白ASSPE subacute sclerosing nencephalitis 亚急性硬化性脊脑炎TAS transcription based amplification system 转录依赖扩增系统TBS Tris bufferred saline Tris缓冲生理盐水TE Trypanosona Equiperdum 马疫锥虫β-TG β-thromboglobulin β-血栓蛋白TG thyroid globulin 甲状腺球蛋白TGF transforming growth factor 转化生长因子TH tyrosine hydroxylase 酪氨酸羟化酶TMB tetramethylbenzidine 四甲基联苯氨TRH thyrotropin releasing hormone 促甲状腺素释放素T(M)RITC tetramethylrhodamine –isothiocyanate 异硫氰酸四甲基诺丹明TSH thyroxin stimulating hormone 促甲状激素UEA Ulex Europaeus agglutinin 荆豆凝集素Vim vimentin 波纹蛋白VIP vasoactive intestinal polypeptide 血管活性肠肽VP Vertical plane 垂直面WGA wheat germ agglutinin 麦胚凝集素。
免疫组织化学
免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用特异性标记荧光 的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗； 石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。 (4)pH9.0甘油缓冲液〔磷酸盐〕封片。 〔必需无自发荧光，无色透亮 〕
▪ 2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体 反响，避开了共价结合，爱护了酶和抗体 的活性。
标记酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被 光镜或电镜观看。
★ 酶反响产物须稳定，不集中，具有 良好定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
标本的固定与保存
好的固定剂除能满足一般组织学固定目 的外，还需要： 〔1〕能快速固定抗原 〔2〕防止抗原物质集中 〔3〕固定后的抗原能被抗体识别，不影响 抗原抗体反响
▪ 常用：10%福尔马林〔酸性〕、乙醇、丙酮、 甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛
▪ 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘 酸-赖氨酸-多聚甲醛〔PLP〕固定液
免疫组织化学
把握内容
▪ 免疫组化的根本原理 ▪ 免疫组化的根本过程 ▪ 免疫组化的染色技术分类 ▪ 常用的免疫组化的染色原理和方法 ▪ 留意事项
免疫组织化学的根本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化 学的分支，它是用免疫学原理〔特 异的抗原抗体反响〕来对组织内抗 原〔或抗体〕的分布进展原位检测
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒使用说明
生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒使用说明Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems规格:1kit保存:2-8℃避光保存产品简介：SP试剂盒，全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase）检测试剂盒。
由于链霉卵白素的分子量是60kDa，有四个亚基可和生物素结合，等电点为6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点，但是由于使用了生物素，所以在某些内源性生物素含量比价高的组织中应慎用。
该系列检测试剂盒是性价比较高的免疫组化检测试剂。
试剂盒内容：试剂（无色液体）：3%H2O2去离子水3ml、6ml或18ml 试剂A（蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液3ml、6ml或18ml 试剂B（黄色液体）：生物素标记山羊抗兔\小鼠IgG3ml、6ml或18ml 试剂C（橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）3ml、6ml或18ml 操作步骤:仅供参考1、石蜡切片，常规脱蜡至水。
2、如需采用抗原修复，在此步骤后进行。
3、3%H2O2去离子水（无色液体）孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
PBS 冲洗，3分钟×3次。
4、滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10~15分钟，倾去，勿洗。
5、滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜。
6、PBS冲洗，3分钟×3次。
7、滴加试剂B（黄色液体），室温或37℃孵育10~15分钟。
8、PBS冲洗，3分钟×3次。
9、滴加试剂C（橙色液体），室温或37℃孵育10~15分钟。
10、PBS冲洗，3分钟×3次。
11、显色剂显色（DAB或AEC）。
12、自来水充分冲洗。
13、如果需要，可进行复染，脱水，透明。
14、选择适当的封片剂封片。
组织与细胞化学技术-2
试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等
消除方法
A. 加 1抗前加正常血清10~30分，以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非 特异性结合。
B . 减少非特异性染色： a.免疫酶组化染色时，加1抗前，用0.3％的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30分 （3％H2O2甲醇溶液，5~10分） b.免疫荧光染色时，用0.01~0.05％伊文思蓝稀释荧光抗体
2. 根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类
（1）直接法 （2）间接法，灵敏度高于直接法。
附：免疫组织化学标本制备过程及要求 1. 取材
实验动物：麻醉 （处死〕，锋利刀片切成大小适中，厚度3mm- 4mm; 小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4％多聚甲醛） 取材
人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织
特性 组成 特异性 亲和力 交叉反应
单克隆抗体与多克隆抗体特性比较
多克隆
单克隆
多种类抗体的混合物
单一种类的抗体
低针对多个抗原决定族 高针对单一的抗原决定族
平均亲和力较高
不定，较低
高
低
五、抗原与抗体特异性结合特点
抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可 变区中有3个特殊的易变部位，即在第30位、50-60位和第100位氨基酸 残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组 成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽大小约I.5nm×0.6nm×0.6nm 抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内，借分子间的范德华力、疏水 作用静电引力以及氢键而相互结合。
组织化学技术分类及基本要求
分类
1. 化学方法：在组织切片上生成沉淀以表示定性定位的存在 2. 类化学方法：用特异性染色显示，如胭脂红显示糖原 3. 物理学方法：用荧光分析、组织吸收光谱等研究组织细胞内的化 学成分 4. 显微烧灰方法：对组织中无机物质和微量元素进行测定 5. 免疫学方法：用免疫学原理 6. 分子生物学方法：如原位杂交组织化学技术
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊，具体如下：
1、烤片，68℃，20分钟，
2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min⇒二甲苯II20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min
3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。
6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；
滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，
苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
免疫组化与原位杂交
显色特点： ---深蓝色
---不溶于水及脂类溶剂 ---不扩散 ---永久保存 2.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP） 碱性磷酸酶的作用物（底物，substrate） 1）四唑淡蓝 /5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(Nitro-BlueTetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlylphosphate, NBT/BCIP） 显色特点： ---紫色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存
二、常用于标记抗体的标记物
一）酶（enzyme） 1.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP） 辣根过氧化物酶的作用物（底物，substrate） 1）二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB） 显色特点： --- 棕色 ---不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯xylene） ---不扩散 ---永久保存 2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）
5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状 的过程。 6）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一 般切3–6μm。 2.冰冻切片的基本步骤： 1）固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及选择 适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当先进行固定以防止 抗原破坏及降解。 常用的固定液是4%多聚甲醛（paraformaldehyde） 2）减少组织水分防止冰晶形成:通常采用高渗的30%蔗糖(sucrose) 溶液吸收组织中的水分。
优点：敏感性高，特异性很低。 缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。
五、免疫组织化学的特异性与敏感性
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
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（六） Envision技术
１、原理
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术：
S-P （ streptavidin －peroxidase）技术
SABC （streptavidin-biotin complex）技术
1、基本原理
2、操作步骤
（1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ； （4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ； （5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃ 30min ； （7） PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC），37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。
（5）滴加第一抗体，37℃ 孵育1h；
第一步
第二步
第三步
第四步
第五步
2、操作步骤
（1） 常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理；
（2） 3% H2Ｏ2甲醇液15min； （3） 正常封闭血清，室温20min，甩干； （4） 滴加特异性一抗4℃过夜或37℃ 孵育1h； （5） PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃ 30min；
（6） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min；
亲和免疫组化技术
(Affinity cytochemistry﹠histochemis高度结合力，包括抗原与抗体、
生物素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白
与IgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素
与受体之间的结合反应等。
第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术
（5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min；
（6） PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色； （7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。
（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法
1、原理
根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物 素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ， 敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。
用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体 ， 具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。
2、操作步骤
（1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗； （2）用3% H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗； （3）抗原修复处理，PBS洗； （4）正常山羊血清封闭 15min；
（二）标记生物素-抗生物素技术
（Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）
1、基本原理
以生物素标 记抗体作第一抗 体，酶标记抗生 物素作为第二抗 体，同S-P技术
LAB法示意图
2、操作步骤
（1）①-④ 步骤与ABC法相同 ； （5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。
（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素
和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ； （7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。
3、ABC法的优点
（1）敏感性高 :结合力强,分子量小; （2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ； （4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于 双重或多重免疫染色 。
（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
1、原理
以生物素标记抗 体作第一抗体，抗生 物素作为第二抗体， 桥接酶标生物素。
2、操作步骤
（1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min； （4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min；
一、基本原理
（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素 （Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ； （二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 。
二、几种经典的抗生物素－生物素染色法
（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术
（六） Envision技术
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术 1．基本原理
2、操作步骤
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗； （2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ； （3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ；
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）：
S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术 （五）CSA（Catalyzed signal amplification）法