基因克隆步骤完整版之欧阳家百创编
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
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一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR 筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
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一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR 方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交； PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置 96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
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1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反响液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC 保管。
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1总RNA提取【2 】(1) 液氮研磨或冰上匀浆试验材料;先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀,室温放置5 min;打开离心计心情预冷(3) 加200 µL氯仿,振荡15 sec,室温放置3 min,分层;(4) 4oC,12,000g,离心15 min;(5) 取上清,加500 μL异丙醇,混匀,室温放置10 min;(6) 4oC,12,000g,离心10 min;(7) 弃上清,加1 mL75%乙醇,沉没洗涤沉淀,振荡充分;再用100%乙醇清洗(8) 4oC,7,500g,离心5 min;(9) 弃上清,离心,用枪汲取过剩液体,放在超净台里湿润后,加50 μL DEPC水,－80oC保存.此操作中所用到的器皿均需经由DEPC灭活RNA酶处理.提取的总RNA需经RNA电泳检测质量,并用紫外分光光度计测定浓度.OD260值为核酸的接收值,OD280值为蛋白的接收值,OD260/280值在1.8-2.0间一般解释该核酸蛋白含量在许可的规模内,可正常应用;此外还有OD230值为多糖和酚类的接收值,比较清洁的核酸OD260/230值能达到 2.2阁下.RNA浓度盘算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40.2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA,操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagentwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)解释书进行.其系统为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL 前提为：42oC,2min;RNA纯化后,即可进行反转录.其系统为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反响液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL 操作前提为：(1) 37oC放置15 min; (2) 85oC,5 sec; (3) 4oC保存.3 PCR按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作,,PCR反响系统如下：Premix Taq 25μL模板5μL引物1 (10 μM)1μL引物2 (10 μM)1μLddH2O 18μL PCR反响前提为：94°C预变性5min;94°C变性30s,53°C退火30s,72°C延长30s,轮回36次;72°C延长10min.PCR反响完毕,取5μL反响产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶收受接管则用10μL反响产物）.4 基因克隆及测序4.1 PCR产物切胶收受接管将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下不雅察并切下预期大小的DNA片断.应用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶收受接管试剂盒进行纯化,步骤如下：(1)均衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）参加500μL均衡液BL,13,400×g离心1 min,倒失落收集管中的废液,吸附柱CB2从新套收受接管集管中;(2) 按100 mg agarose胶参加100μL溶液PC,置于50oC中10 min阁下,半途混匀几回,至胶完整熔化;(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）,室温下13,400×g 离心1 min,倒失落收集管中的废液,吸附柱CB2从新套收受接管集管中;(4)向吸附柱CB2中参加600μL漂洗液PW（加乙醇）,室温下13,400×g离心1 min,倒失落收集管中的废液,吸附柱CB2从新套收受接管集管中;(5) 反复上一步骤;(6) 将吸附柱CB2放入收集管中,室温下13,400×g离心2 min,尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干;(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中,向吸附膜中央地位悬空滴加50µL洗脱缓冲液,室温放置2分钟,13,400×g室温离心2 min,收集到的洗脱液即为收受接管的DNA纯化液;(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳,以检讨纯度,并测量溶液中DNA含量.4.2目标片断与载体衔接(1) 胶收受接管产物与T载体衔接系统,参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒解释书.在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：收受接管DNA 4μLLigation Solution 5μLpMD18-T Vector 1μL(2) 16oC反响30分钟,所得产物保存于－4oC冰箱备用.4.3衔接产物转化E.coli DH5α(1) 将5 µL衔接产物参加到100µLE.coli DH5α感触感染态细胞中,轻轻扭转离心管混匀内容物,冰上静置30 min;(2) 42oC水浴热激转化90 sec,立刻放回冰上,放置3 min;(3) 每管参加500µL LB造就基（室温放置）,37oC 160-180 rpm振荡造就45-60 min,使菌体苏醒并表达抗性基因;(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上参加60-100µL 菌液,用无菌涂布棒轻轻涂布平均后,用Parafilm膜封好;(5) 将造就皿正放,37oC约50 min,待液体全体接收后,倒置平板持续造就10-16 h.4.4转化子的筛选及判定(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落,分离接种到3.5 mL LB液体造就基中（含100 µg/mL Amp）,37oC,165rpm振荡造就10-12 h;(2) 用5µL菌液做模板,进行PCR判定（50 µL 系统）,操作步骤同3.阳性菌液由Invitrogen生物公司测序判定,余下的菌液4oC保存备用;(3) 测序成果在Genbank数据库中进行比对剖析.。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
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1总 RNA 提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温搁置 5 min；翻开离心计预冷(3)加 200 μL氯仿，振荡 15 sec，室温搁置 3 min，分层；(4)4o C，12,000g，离心 15 min；(5)取上清，加 500 μL异丙醇，混匀，室温搁置 10 min；(6)4o C，12,000g，离心 10 min；(7)弃上清，加 1 mL75%乙醇，飘荡清洗积淀，振荡充足；再用 100%乙醇冲洗(8)4o C，7,500g，离心 5 min；(9)弃上清，离心，用枪汲取剩余液体，放在超净台里干燥后，加 50 μ L DEPC 水，－ 80o C 保留。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC 灭活 RNA 酶办理。
提取的总RNA 需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的汲取值， OD280值为蛋白的汲取值， OD260/280值在 1.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白含量在同意的范围内，可正常使用；别的还有 OD230值为多糖和酚类的汲取值，比较洁净的核酸 OD260/230值能达到 2.2 左右。
RNA 浓度计算公式：总 RNA 浓度（μg/mL） =A260×稀释倍数×40。
2 反转录 /cDNA 第一链的合成纯化 RNA 以去除基因组 DNA ，操作按 TaKaRa企业的 PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其系统为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至 10μL 条件为： 42o C，2min；RNA 纯化后，即可进行反转录。
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1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的2反转录/cDNA第一链的合成RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLO 补齐至20μL RNase Free dH2 Array模板5μL 引物1 (10 μM) 1 μL引物2 (10 μM) 1 μLddHO 18μL2PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。
4.3连接产物转化E.coli DH5α(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp（100 µg/m L）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；。
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1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。
目的基因克隆之欧阳家百创编
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？欧阳家百（2021.03.07）1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
整个基因克隆实验流程完整
一、组织总R N A的提取有关试剂： Trizol ；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇； RNase-free水有关仪器：制冰机；液氮 & 研钵 /生物样品研磨仪；高速离心计；移液器（1ml、200μl、100μl/50 μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
有关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml， 200μl/300 μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1. 取暂养草鱼，冰上搁置一段时间，而后解剖，剪取肠道 50~100mg，放入研钵中，加入液氮快速研磨，而后加入 1ml 预冷 TRIzol 试剂，充足研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温搁置 5min，使细胞充足裂解；3.按 1ml Trizol 加入 200μl 氯仿，盖上盖子，快速充足摇匀15s，而后室温搁置 3min ；4.4℃， ,12000g 离心 15min；RNA 存在此时混淆物分为三层，基层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；于无色水相中；5.当心汲取上清液，千万不要汲取中间界面，不然有 DNA 污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温搁置 10min； 4℃， ,12000g 离心 10min；7.弃上清，加入 1ml 75%乙醇清洗；涡旋，悬浮积淀； 4℃， ,12000g 离心 5min；8.弃上清；能够再次用 75%乙醇清洗积淀；9.弃上清；用移液器轻轻汲取管壁或管底的剩余乙醇，注意不要汲取积淀；室温搁置5min 晾干积淀；（ RNA 样品不要过于干燥，不然极难溶解）10.积淀中加入 30μlRNase-free 水，轻弹管壁，使 RNA 溶解。
RNA 质量检测有关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE 电泳缓冲液，溴乙锭（ EB）有关仪器：（超微量分光光度计，移液器（μl 或 2μl 规格， 10μl 规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）有关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架， PCR 管， PCR 管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1） RNA 纯度的检测：测定其 OD260和 OD280的值，依据其 OD260/ OD280的比值，当其比值在 ~之间，说明提取的总 RNA 纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
PCR技术克隆目的基因全过程之欧阳法创编
实验：目的基因克隆（PCR技术）【课前预习】PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。
【目的要求】1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。
2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。
【基本原理】类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板 DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
【实验用品】1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在 25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。
②MgCl2 ：25mmol/L。
③4 种 dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。
④Taq DNA聚合酶 5U/μl。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取之相礼和热创作(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂泊洗濯沉淀，振荡充分；再用100%乙醇洗濯(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪汲取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管.此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理.提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度.OD260值为核酸的汲取值，OD280值为蛋白的汲取值，OD260/280值在1.8-2.0间一样平常阐明该核酸蛋白含量在容许的范围内，可正常运用；此外还有OD230值为多糖和酚类的汲取值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右.RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×浓缩倍数×40.2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以往除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)阐明书进行.其体系为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录.其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC保管.3 PCR按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反应体系如下：Premix Taq 25μL模板5μL引物1 (10 μM)1μL引物2 (10 μM)1μLddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C 退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min.PCR反应终了，取5μL反应产品进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产品）.4 基因克隆及测序4.1 PCR产品切胶回收将PCR产品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段.运用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步调如下：(1)均衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入网络管中）加入500μL均衡液BL，13,400×g离心1 min，倒掉网络管中的废液，吸附柱CB2重新套回网络管中；(2) 按100 mg agarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全消融；(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入网络管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉网络管中的废液，吸附柱CB2重新套回网络管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉网络管中的废液，吸附柱CB2重新套回网络管中；(5) 反复上一步调；(6) 将吸附柱CB2放入网络管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除往漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，完全晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜两头地位悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，网络到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液中DNA含量.(1) 胶回收产品与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒阐明书.在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：回收DNA 4μLLigation Solution 5μLpMD18-T Vector 1μL(2) 16oC反应30分钟，所得产品保管于－4oC冰箱备用.4.3连接产品转化E.coli DH5α(1) 将5 µL连接产品加入到100µLE.coli DH5α感受态细胞中，悄悄旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；(2) 42oC水浴热激转化90 sec，马上放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500µL LB培育基（室温放置），37oC 160-180 rpm振荡培育45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60-100µL菌液，用无菌涂布棒悄悄涂布均匀后，用Parafilm膜封好；(5) 将培育皿正放，37oC约50 min，待液体全部汲取后，倒置平板继续培育10-16 h.(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体培育基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm 振荡培育10-12 h；(2) 用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操纵步调同3.阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC保管备用；(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对分析.。
白血病融合基因之欧阳与创编
bcr/abl融合基因慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。
在受累的细胞系中可找到Ph 标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。
基因结构人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和211共12个外显子。
转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。
abl主要结构有N端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。
SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。
近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。
abl蛋白参与细胞周期调节。
在G0期，ablRb蛋白复合物与DNA结合。
在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S 期。
bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。
蛋白产物分子量均为160。
bcr蛋白第163个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。
bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。
bcr 基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,Mbcr）、次要（minor bcr,mbcr）和μ（μbcr）区域。
abl基因断裂位于第1或第2内含子。
因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。
CML的bcr基因断裂点常位于Mbcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。
bcr基因在ALL 中大约2/3为mBCR位点。
Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。
由于t(9；22)(q34；q11.2)而产生的费城染色体（Ph）在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90%以上的CML、30%的成人ALL、2%10%的儿童ALL、以及少数的AML和MM患者。
基因克隆步骤完整版之欧阳结创编
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；掀开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反响液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL操纵条件为：(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC保管。
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1总RNA提取
欧阳家百（2021.03.07）
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；
(4) 4oC，12,000g，离心15 min；
(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4oC，12,000g，离心10 min；
(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗
(8) 4oC，7,500g，离心5 min；
(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较
干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：
Total RNA 1μg
5× gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL
PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL
RT Primer Mix 1μL
上一步的反响液10μL
RNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：
(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC保管。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反响体系如下：
Premix Taq 25μL
模板5μL
引物1 (10 μM)1μL
引物2 (10 μM)1μL
ddH2O 18μL PCR反响条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
PCR反响完毕，取5μL反响产品进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反响产品）。
4 基因克隆及测序
4.1 PCR产品切胶回收
将PCR产品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期年夜小的DNA片段。
使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步调如下：
(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(2) 按100 mg agarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下
13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(5) 重复上一步调；
(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，完全晾干；
(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；
(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液中DNA含量。
4.2目的片段与载体连接
(1) 胶回收产品与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18T 载体的试剂盒说明书。
在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：
回收DNA 4μL
Ligation Solution 5μL
pMD18T Vector 1μL
(2) 16oC反响30分钟，所得产品保管于－4oC冰箱备用。
4.3连接产品转化E.coli DH5α
(1) 将5 µL连接产品加入到100µLE.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；
(2) 42oC水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；
(3) 每管加入500µL LB培养基（室温放置），37oC 160180 rpm
振荡培养4560 min，使菌体苏醒并表达抗性基因；
(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60100µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；
(5) 将培养皿正放，37oC约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养1016 h。
4.4转化子的筛选及鉴定
(1) 用无菌枪头挑取LB平板上35个单菌落，辨别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm振荡培养1012 h；
(2) 用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操纵步调同3。
阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC 保管备用；
(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对阐发。