脂质体毛细管电泳研究进展
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随着生物膜色谱(Biomembrane Chromatography)的发展，脂质体作为一种分析工具受到了越来越 多的关注，并成为近年来较为活跃的研究领域[2,3]。生物膜色谱是一种新型液相色谱模式，它以天然 或人工模拟生物膜为固定相，主要用来研究溶质分子与生物膜间的相互作用。目前，最常用的生物 膜色谱固定相是固定化脂质体[4~6]，因为它能更好地模拟生物膜的脂双层结构，并具备生物膜的流动 性特征。这种人工模拟的生物膜体系不仅可以精确地模拟生物膜的化学环境，而且其物理性能也可 以通过调节温度、pH、离子强度等得到有效控制。
脂质体层 生物素－磷脂酰乙醇胺
熔融石英毛细管的横切面
生物素酰基化的脂质体
被结合的抗生物素蛋白 用于连接的抗生物素蛋白 亲水涂层 毛细管壁
图 1 抗生物素蛋白-生物素亲和法制备毛细管脂质体涂层示意图[31] Fig.1 A schematic diagram of biotinylated liposomes assembled on a capillary wall mediated by avidin molecules[31]
பைடு நூலகம்
w057
1 脂质体的制备
目前，脂质体的制备技术已经相当成熟，有关报道和综述也较多[8~10]。常用脂质体制备方法有 薄膜分散法、注入法、超声分散法、冷冻干燥法、冻融法、逆相蒸发法、复乳法等。
LCE 中所用的脂质体主要是单室脂质体。多室脂质体由于背景噪声大，灵敏度低而不适合。与 固定化脂质体色谱相比(毛希琴等[11]曾对固定化脂质体色谱中脂质体的制备方法作过较为详细的介 绍)，LCE 中的脂质体制备方法比较单一，通常采用薄膜-超声分散法和薄膜-挤压分散法。薄膜-超声 分散法是制备单室脂质体的最早方法，即将磷脂、胆固醇等类脂质溶于有机溶剂中，旋转蒸发除去 有机溶剂，使在烧瓶内壁形成薄膜，然后将水溶性介质加入烧瓶中并不断振荡，得到多室脂质体， 最后经超声处理得到单室脂质体，其粒径大小依超声时间的长短而不同。薄膜-超声分散法的缺点是 其制备的脂质体粒径分布不太均匀，内层的磷脂分子数要小于外层的磷脂分子数，热力学不稳定， 脂质体之间容易发生融合[12]。薄膜-挤压分散法是目前制备单室脂质体的最常用方法。这种方法也是 先采用薄膜法制得多室脂质体，然后在一定压力(<7.091×105Pa)下使大多室脂质体通过很小孔径的聚 碳酸酯膜，以获得大小均匀的单室脂质体[13]。
ILCE 的脂质体涂层是磷脂双层(涂层在毛细管内壁的脂质体破裂，相互融合)还是囊泡层(涂层 在毛细管内壁的脂质体形态完整)，取决于多种因素如脂质体的制备方法、粒径大小、载体材料及浓 度、电泳缓冲液中 Ca2+存在与否等[12,32,33]。脂质体涂层的稳定性与固定化方法有很大关系。氢键吸 附法、静电吸附法等非共价键合的方法，操作过程简单，但脂质体涂层稳定性差，流失严重；亲和 法则使脂质体涂层的稳定性得到明显改善，缺点是制作成本相对较高。下面对这些固定化方法进行 一一介绍。 2.1 氢键吸附法
LCE 中，溶质的分离主要基于不同溶质在电泳缓冲液和脂质体(LECC 中为假固定相，ILCE 中
为涂层)之间的分配系数不同而进行的。溶质的带电量、化学结构、极性、甚至浓度都会影响溶质的 分配系数大小[34,35]。另外，在分配过程中，不同溶质在脂质体中的分配部位也可能不同(极性区域或 疏水区域)[36]。
2
http://www.hxtb.org
化学通报 2006 年 第 69 卷
w057
类等因素的影响，其中电泳缓冲液的种类对负性脂质体涂层的涂层效果影响最大；采用三(三羟甲基 氨基甲烷)缓冲液、磷酸盐缓冲液和麦黄酮(N-三羟甲基甲基甘氨酸)缓冲液制备的脂质体涂层，电渗 流(EOF)有少许增加(1%～7%)，而用 HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)]缓冲液制备的脂质体 涂层，EOF 减少 24%，这表明在 HEPES 缓冲液中，脂质体与毛细管内壁的作用最强，因而得到最 好的涂层效果。Wiedmer 等[28]尝试用一系列与 HEPES 结构相似的化合物(均含哌嗪基团)溶液作为电 泳缓冲液，结果发现采用这些缓冲液制备的负性脂质体(组成成分：磷脂酰胆碱(PC)/PS)涂层也相当 稳定。另外，在电泳缓冲液中加入二价金属离子(如 Ca2+，Mg2+，Zn2+)或电泳温度在相变温度以下 时均能增加磷脂膜的刚性，提高脂质体涂层的稳定性[25,26]。 2.2 静电吸附法
首先将抗生物素蛋白共价键合到氨基化的毛细管内壁，然后将生物素酰基化的脂质体填充到键 合有抗生物素蛋白的毛细管内(如图 1)。通过抗生物素蛋白-生物素的亲和作用力将脂质体固定在毛 细管内表面。由于溶解脂质体的电泳缓冲液中含有抗生物素蛋白，因而单个生物素酰基化的脂质体 之间也可通过亲和作用力发生聚合。与氢键吸附法制备的脂质体涂层相比，亲和法制备的脂质体涂 层其稳定性有了相当程度的提高，因为抗生物素蛋白与生物素间的亲和作用力比氢键作用力强得多。 在涂层过程中还发现，毛细管内壁覆盖了 4～15 层脂质体，且采用大单室脂质体制备的脂质体涂层 所固定的磷脂含量要比采用小单室脂质体制备的脂质体涂层所固定的磷脂含量高出 2 倍。
固定化脂质体色谱具有许多优点，但是它的应用并不广泛，主要原因是制柱比较困难、成本高。 其次高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)常用的硅胶基质及其化学键合 固定相的 pH 适用范围较窄(2～8)，色谱柱易被污染且难再生，流动相需要大量有机溶剂，成本较高， 且污染环境。与固定化脂质体色谱相比，脂质体毛细管电泳(Liposome Capillary Electrophoresis，LCE) 更有优势，其具有制备简便、溶剂消耗少、进样量小、成本低等优点。1995 年 Zhang 等[7]首次提出 了 LCE 的概念，10 年来，LCE 已经得到了较快发展，无论是在方法学方面，还是在应用方面都有 了比较深入的研究。
Key words Liposome, Capillary electrophoresis
自 1965 年由英国的 Bangham 等[1]首先发现磷脂在水中可以自发形成脂质体(Liposome)以来，对 脂质体的实验研究日渐广泛，已遍及生命科学、膜工程学等领域，并逐渐向临床应用发展。脂质体 是由磷脂和其它两亲性物质分散于水中形成的由一层或多层同心脂质双分子膜包封而成的球状体， 具有亲水性和疏水性两性性质。依其所含脂质双分子层的层数，脂质体可分为单室脂质体和多室脂 质体。其中单室脂质体又可根据粒径的大小分为小单室脂质体(粒径范围 0.02～0.08μm)和大单室脂 质体(粒径范围 0.1～1μm)。
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化学通报 2006 年 第 69 卷
w057
脂质体毛细管电泳研究进展
肖玉秀 梅洁 程伟
(武汉大学药学院 武汉 430072)
摘 要 脂质体毛细管电泳是近年新发展起来的一种分离分析技术。本文较系统地综述了脂质体毛 细管电泳的脂质体制备方法、分类、原理、脂质体涂层制备方法以及应用，以期促进脂质体毛细管电泳的 发展。
关键词 脂质体 毛细管电泳
Progress in Liposome Capillary Electrophoresis
Xiao Yuxiu, Mei Jie, Cheng Wei
(College of Pharmacy, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract Liposome capillary electrophoresis (LCE) is a recent approach and playing more important role in the separation and analysis process. In this review, the preparation of liposome, classification, theory, preparation of liposome coating on the capillary inner wall and applications of LCE are described in detail.
先将带电荷的化合物涂布于毛细管内壁，然后将带相反电荷的脂质体填充于毛细管中，则脂质 体依靠静电作用力吸附于毛细管内壁。因为静电作用力比氢键作用力大，所以这种方法制备的脂质 体涂层比氢键吸附法制备的脂质体涂层更稳定一些。
Ǒrnskov 等[30]先将琼脂糖衍生物(含有带正电荷的铵离子)涂布于毛细管内壁，然后用含有负性脂 质体(组成成分：POPC/PS)的溶液冲洗毛细管 5min，则负性脂质体通过静电作用力吸附在带正电荷 的毛细管内壁。实验发现，随着涂布于毛细管内壁的琼脂糖衍生物电荷密度的增加，固定在毛细管 内壁的脂质体含量增大，一系列非离子化合物在 ILCE 中的保留值增大。这证明在脂质体的涂层过 程中，静电作用力确实起主要作用。 2.3 抗生物素蛋白-生物素亲和法
该法十分简便，只需将含有脂质体的电泳缓冲液与毛细管平衡数分钟，此时由于脂质体中磷脂 的－P＝O 基团与融熔石英毛细管内壁的硅羟基产生氢键作用力，而使脂质体充分吸附于毛细管内 壁，然后用不含脂质体的电泳缓冲液冲洗，除去未吸附的脂质体即可。但是对于负性脂质体而言， 该法不太稳定，因为毛细管内壁的硅羟基会与负性脂质体发生相互排斥作用。
2 LCE 的分类及脂质体涂层的制备
LCE 大体可分为两类。一类从电泳缓冲液入手，将脂质体作为添加剂，直接加入电泳缓冲液中， 形成假固定相，其基本原理与胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography， MECC) 类 似 ， 因 而 被 称 之 为 “ 脂 质 体 电 动 毛 细 管 色 谱 (Liposome Electrokinetic Capillary Chromatography，LECC)”[7,14~22]。另一类从毛细管管壁入手，将脂质体作为涂层剂，采用氢键吸附 法[23~28]、静电吸附法[29,30]、抗生物素蛋白-生物素亲和法[31]等固定化方法，使毛细管内壁形成较稳定 的 脂 质 体 涂 层 ， 因 而 可 称 之 为 “ 固 定 化 脂 质 体 毛 细 管 电 泳 (Immobilized Liposome Capillary Electrophoresis, ILCE)”。两者相比，ILCE 的柱效较低，但其脂质体的消耗少，并可与质谱联用[2]。
3 LCE 的应用
LCE 的应用领域主要分为三个方面：(1)在各种有机化合物及多肽、蛋白质分离中的应用；(2)
3
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在对映异构体分离中的应用；(3)在药物-生物膜相互作用研究中的应用。
3.1 LCE 在各种有机化合物及多肽、蛋白质分离中的应用
肖玉秀 女，39 岁，博士，副教授，主要从事药物分析研究。E-mail: yuxiuxiao@yahoo.com.cn 武汉大学回国留学人员启动基金资助项目(502-276130) 2005-08-25 收稿，2006-01-11 接受
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Hautala 等[23]选用平均粒径大约 100nm 的大单室负性脂质体(组成成分：1-棕榈酰-2-油酸-3-磷脂 酰胆碱/磷脂酰丝氨酸/胆固醇，POPC/PS/Cholesterol)，通过氢键吸附法制备了 LCE 的脂质体涂层。 具体涂层过程为：0.5mol/L 盐酸冲洗裸露熔融石英毛细管 10min→水冲洗 15min→电泳缓冲液冲洗 5min→含有脂质体的电泳缓冲液冲洗 10min→含有脂质体的电泳缓冲液在毛细管内预稳定 15min→ 电泳缓冲液冲洗除去未吸附的脂质体。在整个涂层过程中，电泳缓冲液的种类保持相同。Hautala 等发现，脂质体涂层的最终效果和稳定性受到冲洗脂质体溶液的时间、分析电压、电泳缓冲液的种
脂质体层 生物素－磷脂酰乙醇胺
熔融石英毛细管的横切面
生物素酰基化的脂质体
被结合的抗生物素蛋白 用于连接的抗生物素蛋白 亲水涂层 毛细管壁
图 1 抗生物素蛋白-生物素亲和法制备毛细管脂质体涂层示意图[31] Fig.1 A schematic diagram of biotinylated liposomes assembled on a capillary wall mediated by avidin molecules[31]
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1 脂质体的制备
目前，脂质体的制备技术已经相当成熟，有关报道和综述也较多[8~10]。常用脂质体制备方法有 薄膜分散法、注入法、超声分散法、冷冻干燥法、冻融法、逆相蒸发法、复乳法等。
LCE 中所用的脂质体主要是单室脂质体。多室脂质体由于背景噪声大，灵敏度低而不适合。与 固定化脂质体色谱相比(毛希琴等[11]曾对固定化脂质体色谱中脂质体的制备方法作过较为详细的介 绍)，LCE 中的脂质体制备方法比较单一，通常采用薄膜-超声分散法和薄膜-挤压分散法。薄膜-超声 分散法是制备单室脂质体的最早方法，即将磷脂、胆固醇等类脂质溶于有机溶剂中，旋转蒸发除去 有机溶剂，使在烧瓶内壁形成薄膜，然后将水溶性介质加入烧瓶中并不断振荡，得到多室脂质体， 最后经超声处理得到单室脂质体，其粒径大小依超声时间的长短而不同。薄膜-超声分散法的缺点是 其制备的脂质体粒径分布不太均匀，内层的磷脂分子数要小于外层的磷脂分子数，热力学不稳定， 脂质体之间容易发生融合[12]。薄膜-挤压分散法是目前制备单室脂质体的最常用方法。这种方法也是 先采用薄膜法制得多室脂质体，然后在一定压力(<7.091×105Pa)下使大多室脂质体通过很小孔径的聚 碳酸酯膜，以获得大小均匀的单室脂质体[13]。
ILCE 的脂质体涂层是磷脂双层(涂层在毛细管内壁的脂质体破裂，相互融合)还是囊泡层(涂层 在毛细管内壁的脂质体形态完整)，取决于多种因素如脂质体的制备方法、粒径大小、载体材料及浓 度、电泳缓冲液中 Ca2+存在与否等[12,32,33]。脂质体涂层的稳定性与固定化方法有很大关系。氢键吸 附法、静电吸附法等非共价键合的方法，操作过程简单，但脂质体涂层稳定性差，流失严重；亲和 法则使脂质体涂层的稳定性得到明显改善，缺点是制作成本相对较高。下面对这些固定化方法进行 一一介绍。 2.1 氢键吸附法
LCE 中，溶质的分离主要基于不同溶质在电泳缓冲液和脂质体(LECC 中为假固定相，ILCE 中
为涂层)之间的分配系数不同而进行的。溶质的带电量、化学结构、极性、甚至浓度都会影响溶质的 分配系数大小[34,35]。另外，在分配过程中，不同溶质在脂质体中的分配部位也可能不同(极性区域或 疏水区域)[36]。
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类等因素的影响，其中电泳缓冲液的种类对负性脂质体涂层的涂层效果影响最大；采用三(三羟甲基 氨基甲烷)缓冲液、磷酸盐缓冲液和麦黄酮(N-三羟甲基甲基甘氨酸)缓冲液制备的脂质体涂层，电渗 流(EOF)有少许增加(1%～7%)，而用 HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)]缓冲液制备的脂质体 涂层，EOF 减少 24%，这表明在 HEPES 缓冲液中，脂质体与毛细管内壁的作用最强，因而得到最 好的涂层效果。Wiedmer 等[28]尝试用一系列与 HEPES 结构相似的化合物(均含哌嗪基团)溶液作为电 泳缓冲液，结果发现采用这些缓冲液制备的负性脂质体(组成成分：磷脂酰胆碱(PC)/PS)涂层也相当 稳定。另外，在电泳缓冲液中加入二价金属离子(如 Ca2+，Mg2+，Zn2+)或电泳温度在相变温度以下 时均能增加磷脂膜的刚性，提高脂质体涂层的稳定性[25,26]。 2.2 静电吸附法
首先将抗生物素蛋白共价键合到氨基化的毛细管内壁，然后将生物素酰基化的脂质体填充到键 合有抗生物素蛋白的毛细管内(如图 1)。通过抗生物素蛋白-生物素的亲和作用力将脂质体固定在毛 细管内表面。由于溶解脂质体的电泳缓冲液中含有抗生物素蛋白，因而单个生物素酰基化的脂质体 之间也可通过亲和作用力发生聚合。与氢键吸附法制备的脂质体涂层相比，亲和法制备的脂质体涂 层其稳定性有了相当程度的提高，因为抗生物素蛋白与生物素间的亲和作用力比氢键作用力强得多。 在涂层过程中还发现，毛细管内壁覆盖了 4～15 层脂质体，且采用大单室脂质体制备的脂质体涂层 所固定的磷脂含量要比采用小单室脂质体制备的脂质体涂层所固定的磷脂含量高出 2 倍。
固定化脂质体色谱具有许多优点，但是它的应用并不广泛，主要原因是制柱比较困难、成本高。 其次高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)常用的硅胶基质及其化学键合 固定相的 pH 适用范围较窄(2～8)，色谱柱易被污染且难再生，流动相需要大量有机溶剂，成本较高， 且污染环境。与固定化脂质体色谱相比，脂质体毛细管电泳(Liposome Capillary Electrophoresis，LCE) 更有优势，其具有制备简便、溶剂消耗少、进样量小、成本低等优点。1995 年 Zhang 等[7]首次提出 了 LCE 的概念，10 年来，LCE 已经得到了较快发展，无论是在方法学方面，还是在应用方面都有 了比较深入的研究。
Key words Liposome, Capillary electrophoresis
自 1965 年由英国的 Bangham 等[1]首先发现磷脂在水中可以自发形成脂质体(Liposome)以来，对 脂质体的实验研究日渐广泛，已遍及生命科学、膜工程学等领域，并逐渐向临床应用发展。脂质体 是由磷脂和其它两亲性物质分散于水中形成的由一层或多层同心脂质双分子膜包封而成的球状体， 具有亲水性和疏水性两性性质。依其所含脂质双分子层的层数，脂质体可分为单室脂质体和多室脂 质体。其中单室脂质体又可根据粒径的大小分为小单室脂质体(粒径范围 0.02～0.08μm)和大单室脂 质体(粒径范围 0.1～1μm)。
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w057
脂质体毛细管电泳研究进展
肖玉秀 梅洁 程伟
(武汉大学药学院 武汉 430072)
摘 要 脂质体毛细管电泳是近年新发展起来的一种分离分析技术。本文较系统地综述了脂质体毛 细管电泳的脂质体制备方法、分类、原理、脂质体涂层制备方法以及应用，以期促进脂质体毛细管电泳的 发展。
关键词 脂质体 毛细管电泳
Progress in Liposome Capillary Electrophoresis
Xiao Yuxiu, Mei Jie, Cheng Wei
(College of Pharmacy, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract Liposome capillary electrophoresis (LCE) is a recent approach and playing more important role in the separation and analysis process. In this review, the preparation of liposome, classification, theory, preparation of liposome coating on the capillary inner wall and applications of LCE are described in detail.
先将带电荷的化合物涂布于毛细管内壁，然后将带相反电荷的脂质体填充于毛细管中，则脂质 体依靠静电作用力吸附于毛细管内壁。因为静电作用力比氢键作用力大，所以这种方法制备的脂质 体涂层比氢键吸附法制备的脂质体涂层更稳定一些。
Ǒrnskov 等[30]先将琼脂糖衍生物(含有带正电荷的铵离子)涂布于毛细管内壁，然后用含有负性脂 质体(组成成分：POPC/PS)的溶液冲洗毛细管 5min，则负性脂质体通过静电作用力吸附在带正电荷 的毛细管内壁。实验发现，随着涂布于毛细管内壁的琼脂糖衍生物电荷密度的增加，固定在毛细管 内壁的脂质体含量增大，一系列非离子化合物在 ILCE 中的保留值增大。这证明在脂质体的涂层过 程中，静电作用力确实起主要作用。 2.3 抗生物素蛋白-生物素亲和法
该法十分简便，只需将含有脂质体的电泳缓冲液与毛细管平衡数分钟，此时由于脂质体中磷脂 的－P＝O 基团与融熔石英毛细管内壁的硅羟基产生氢键作用力，而使脂质体充分吸附于毛细管内 壁，然后用不含脂质体的电泳缓冲液冲洗，除去未吸附的脂质体即可。但是对于负性脂质体而言， 该法不太稳定，因为毛细管内壁的硅羟基会与负性脂质体发生相互排斥作用。
2 LCE 的分类及脂质体涂层的制备
LCE 大体可分为两类。一类从电泳缓冲液入手，将脂质体作为添加剂，直接加入电泳缓冲液中， 形成假固定相，其基本原理与胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography， MECC) 类 似 ， 因 而 被 称 之 为 “ 脂 质 体 电 动 毛 细 管 色 谱 (Liposome Electrokinetic Capillary Chromatography，LECC)”[7,14~22]。另一类从毛细管管壁入手，将脂质体作为涂层剂，采用氢键吸附 法[23~28]、静电吸附法[29,30]、抗生物素蛋白-生物素亲和法[31]等固定化方法，使毛细管内壁形成较稳定 的 脂 质 体 涂 层 ， 因 而 可 称 之 为 “ 固 定 化 脂 质 体 毛 细 管 电 泳 (Immobilized Liposome Capillary Electrophoresis, ILCE)”。两者相比，ILCE 的柱效较低，但其脂质体的消耗少，并可与质谱联用[2]。
3 LCE 的应用
LCE 的应用领域主要分为三个方面：(1)在各种有机化合物及多肽、蛋白质分离中的应用；(2)
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在对映异构体分离中的应用；(3)在药物-生物膜相互作用研究中的应用。
3.1 LCE 在各种有机化合物及多肽、蛋白质分离中的应用
肖玉秀 女，39 岁，博士，副教授，主要从事药物分析研究。E-mail: yuxiuxiao@yahoo.com.cn 武汉大学回国留学人员启动基金资助项目(502-276130) 2005-08-25 收稿，2006-01-11 接受
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Hautala 等[23]选用平均粒径大约 100nm 的大单室负性脂质体(组成成分：1-棕榈酰-2-油酸-3-磷脂 酰胆碱/磷脂酰丝氨酸/胆固醇，POPC/PS/Cholesterol)，通过氢键吸附法制备了 LCE 的脂质体涂层。 具体涂层过程为：0.5mol/L 盐酸冲洗裸露熔融石英毛细管 10min→水冲洗 15min→电泳缓冲液冲洗 5min→含有脂质体的电泳缓冲液冲洗 10min→含有脂质体的电泳缓冲液在毛细管内预稳定 15min→ 电泳缓冲液冲洗除去未吸附的脂质体。在整个涂层过程中，电泳缓冲液的种类保持相同。Hautala 等发现，脂质体涂层的最终效果和稳定性受到冲洗脂质体溶液的时间、分析电压、电泳缓冲液的种