海藻糖在血细胞冻干保存中的应用
海藻糖在细胞冻存的作用
海藻糖在细胞冻存的作用介绍细胞冻存是一种常用的生物学技术，用于长期保存各种细胞类型。
然而，细胞在冻存和解冻过程中容易受到损伤，导致细胞存活率下降和功能丧失。
因此，寻找提高细胞冻存效果的方法成为了研究的热点之一。
海藻糖是一种天然存在于一些低温环境中的糖分，具有保护细胞免受冷冻损伤的能力。
本文将深入探讨海藻糖在细胞冻存过程中的作用机制和应用前景。
海藻糖的化学结构海藻糖是一种二糖，由葡萄糖和半乳糖组成。
它与蔗糖和乳糖有着相似的结构，但在细胞冻存中表现出独特的保护作用。
海藻糖的保护机制海藻糖在细胞冻存中的保护作用主要有以下几个方面：1. 渗透调节作用海藻糖具有良好的渗透适应性，可以在细胞冻存过程中调节细胞内外渗透平衡。
当细胞接触到低温时，细胞内的水分会结晶形成冰晶，导致细胞内外渗透压不一致，进而引发细胞脱水和损伤。
海藻糖可以通过调节细胞内外的渗透浓度，减少冰晶的形成，从而降低细胞的冻脱水损伤。
2. 抗冷冻损伤作用海藻糖可在细胞冻结过程中迅速结合并保护细胞的膜结构，防止冷冻引起的膜脂溶解和膜蛋白变性。
此外，海藻糖还能抑制冷冻引起的胞内钙离子上升，减少钙离子对细胞的损伤。
这些作用有助于维持细胞的完整性和功能。
3. 抗氧化应激作用细胞在冻存和解冻过程中容易受到氧化应激的影响，导致细胞内氧化物水平升高并引发细胞死亡。
海藻糖具有抗氧化活性，可以减少细胞氧化应激的程度，保护细胞免受损伤。
海藻糖在细胞冻存中的应用海藻糖在细胞冻存中的应用已经得到了广泛的认可和应用。
1. 细胞冻存液的配方优化海藻糖可以作为一种优秀的细胞冻存液添加剂，与其他冻存液成分相结合，提高细胞冻存的效果。
通过优化冻存液的配方，可以有效提高细胞的存活率和功能恢复能力。
2. 细胞冻存过程中的预处理在细胞冻存前预处理细胞，浸泡海藻糖溶液中，可以增强细胞对冻存过程的适应能力。
海藻糖可以渗透入细胞内，增加细胞内的渗透压，有效减少细胞的冻脱水损伤。
此外，通过海藻糖的预处理，还可以激活细胞内一些抗损伤蛋白的表达，提高细胞的抗冷冻和抗氧化能力。
胞内海藻糖对红细胞冷冻干燥保存效果的影响
ｔ ｃ ｌ ｌｒ ｒｈ Ｉｓ ｎ ｔｅｖａ ｉ ｒ ｚ ｒｅ ｌａ ｅ ａｏ ｅｏ ｈ ｉ ｌ ｏ ｆｅ ｅ—ｄ ｉ ｅ ｌｏ ｌ ｒ ｖ ｓｉａｅ ．Ｔ ｅｆｅ ｈｒ ｌｏ ｌ ｒ ． ａ ｕ ｔ ｂｉ ｆ ｙ ｔ ｒ ｒ ｂｏ ｄ ｃ ｌ ｗｅｅ ｉ ｅ ｔ ｔ ｄ ｅ ｄ ｅ ｓ ｎ ｇ ｄ ｈ ｒｓ ｅ ｂｏ ｄ ｃ ｌ ｗｅ ｉ ｄ ｅ ｓ ｅ ｎ
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Ｉ 引
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的增加 ， 内海藻糖的浓度相应升高 ， 胞 试验中海藻糖浓度最高达到 ３ｍ ｏ Ｌ ５ ｍ ｌ 。对 新鲜与孵 育后红细胞 在相 同条件 下 ／
进行冻干实验 ， 结果表明， 孵育后的红细胞冻干回收率随胞内海藻糖浓度增加而加 ， 表明胞内海藻糖在冻干过程
中对红细胞有保护作用 。
关键词 医学细胞生物学 ； 细胞 ； 冻干燥 ； 人 ； 藻糖 ； 红 冷 载 海 回收 率
海藻糖的应用研究
海藻糖的应用研究摘要研究发现，海藻糖具有良好的辅助动植物增强其抗逆性的功能。
海藻糖独特的性能使其在在食品、生物医药及农业生产领域的有着非常广泛的应用价值。
关键词海藻糖；食品；生物；农业；应用价值研究表明，某些物种对外界恶劣环境所表现出的较强的抗逆耐性与其体内存在海藻糖有关系。
海藻糖能够有效的保护细胞膜和蛋白质的空间构象，因此许多含有海藻糖的动植物干燥失水后仍维持活性，一旦遇水就立刻复活，从而可保存其固有的风味、色泽和纹理。
研究表明，外源性的海藻糖对生物体和生物大分子亦具有良好的非特异性保护作用。
在海藻糖存在的条件下，各种保存条件要求苛刻的基因工程酶类疫苗和抗体等干燥复水后的仍具有良好的功能性。
由于海藻糖具有这种奇妙的特性，使其在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用价值，成为一项极有开发和应用前景的产品。
1 海藻糖在食品方面的应用在食品加工方面，海藻糖作为一种天然食品添加剂具有改善干燥加工食品质量和风味的作用。
此外，海藻糖也可广泛应用于奶类、果汁饮料、蔬菜汁、风味调料等的防腐保鲜。
海藻糖属于一种非特异性保护剂，几乎对所有的生物分子都具有一定的保护功能，而且它的化学性质非常稳定，具有不易焦糖化，甜度低，在人体内可被分解为葡萄糖等特点，可以作为一种新型的天然防腐剂来使用。
目前，己有将其用于奶类、禽蛋及番茄酱等食品的保存。
海藻糖还是一种能改善干燥食品质量和风味的天然食品添加剂。
海藻糖可与食盐共存，能增强食品优良口味，改善口感。
而在蔗糖中加入一定量的海藻糖，使其甜味优良，可广泛用于调味料、点心、面包、口香糖、火腿、乳制品等产品种来使用。
无水海藻糖有很强的吸湿性，是一种天然脱水剂。
通过无水海藻糖吸收水分后变为结晶海藻糖，可以有效地防止粉末状食品粘着结块。
因此，无水海藻糖可广泛用于糖衣食品、各种点心、颗粒佐料、酥脆饼干等。
此外，海藻糖还具有抗干燥，化学稳定性强和甜度低等特点。
海藻糖能阻止还原糖和游离氨基发生反应，从而抑制美拉德反应的发生。
海藻糖在细胞冻存的作用
海藻糖在细胞冻存的作用
海藻糖是一种具有保护细胞的作用的糖类物质，它可以在细胞冻存过
程中发挥重要的作用。
细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，它可以
将细胞保存在极低的温度下，以便在需要时重新使用。
然而，细胞冻
存过程中会受到很多不利因素的影响，如低温、冷冻剂、冷冻和解过
程中的压力等，这些因素都会对细胞造成损伤。
海藻糖可以通过一系
列的机制来保护细胞，从而提高细胞冻存的成功率。
首先，海藻糖可以保护细胞膜的完整性。
细胞膜是细胞的外层保护层，它可以控制物质的进出，维持细胞内外环境的稳定。
在细胞冻存过程中，低温和冷冻剂会导致细胞膜的破裂和失去完整性，从而导致细胞
死亡。
海藻糖可以通过与细胞膜中的脂质分子结合，形成一层保护层，从而保护细胞膜的完整性，减少细胞死亡。
其次，海藻糖可以减少细胞内的冰晶形成。
在细胞冻存过程中，水分
子会形成冰晶，从而导致细胞内部的结构和功能受到破坏。
海藻糖可
以通过与水分子结合，形成一种类似于胶体的物质，从而减少冰晶的
形成，保护细胞内部的结构和功能。
最后，海藻糖可以促进细胞的代谢活动。
在细胞冻存过程中，细胞的
代谢活动会受到抑制，从而导致细胞死亡。
海藻糖可以通过提供能量
和营养物质，促进细胞的代谢活动，从而增强细胞的生存能力。
综上所述，海藻糖在细胞冻存中发挥着重要的作用，它可以保护细胞膜的完整性，减少细胞内的冰晶形成，促进细胞的代谢活动，从而提高细胞冻存的成功率。
因此，在细胞冻存过程中，加入适量的海藻糖可以有效地保护细胞，提高细胞的存活率，为细胞的研究和应用提供了重要的保障。
海藻糖的应用简述
海藻糖的应用简述摘要：海藻糖是一种新型天然糖，无毒无害，能在细胞表面形成保护膜。
海藻糖的抗逆保护机理，存在三种假说。
海藻糖在医学领域，生鲜食品保鲜，化妆品中广泛应用。
关键词：海藻糖，保护机理，医学领域，生鲜食品保鲜，化妆品，应用前言：海澡糖，又名为漏芦糖，是一种非还原性双糖，由两个葡萄糖分子组成。
海藻糖是无毒无害的一种新型天然糖。
海藻糖是一种典型的应激代谢物，在干燥失水、高温、高寒等环境下，能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，维持生命体的生命过程和生命特征，被誉为“生命之糖”。
早在1882年，人们最初在麦角菌中，把海藻糖分离出来。
发现它在细菌，真菌，植物和无脊椎动物中广泛存在。
还发现它是受环境胁迫才产生，含量受外界影响而变化，是一种应激代谢物。
海藻糖性质稳定，无色无味，在人体内可水解为葡萄糖。
具有保护蛋白质结构及抗干燥作用，在食品干燥前加入海藻糖，可防止蛋白质变性，干燥产品冲水调制后十分接近原来的物质。
近年来，在医药用品，化妆品，食品，保健品领域，广泛运用海藻糖。
海藻糖的抗逆保护机理假说海藻糖的抗逆保护机理，存在三种假说。
优先阻排假说。
一种是水代替假说。
有人认为生物体周围有一层水膜包围。
当生物体受外界干扰时，这层水膜慢慢去除，构成生物体的蛋白质、脂肪等物质发生变化。
蛋白质在某种情况失水时，海藻糖代替原来的水分子，保持原有结构，而不失活。
另一种是玻璃态假说。
有人认为糖含水量较低时，形成非晶态结构。
一种是玻璃态，一种是高弹态，还有一种是黏流态。
玻璃态转化转变就是指玻璃态到高弹态的转变，或者是高弹态到玻璃态的转变。
在干燥时，海藻糖使相近的分子，形成糖玻璃体，从而保持生物体的活性。
还有一种是优先阻排假说。
有人认为，海藻糖优先与水结合，使蛋白质表观体积减少，移动性减弱，从而使生物分子结构更加紧密，更加稳定。
海藻糖在医学领域的应用在遭遇饥饿，高温，辐射等不良环境刺激时，生物体内的海藻糖对生物体及生物大分子的活性起良好的保护作用。
海藻糖抗冻原理
海藻糖抗冻原理
海藻糖是一种特殊的糖类分子，能够在环境温度极低的情况下保护生物体内的细胞和组织不受冰冻的损害。
其抗冻原理主要是通过以下两个方面实现的：
首先，海藻糖可以在冰冻之前，将水分子从生物体内抽出，形成类似于胶体的物质，从而减少细胞内水分的活性，避免因水结冰而引起的机械破坏。
同时，海藻糖还能够稳定细胞膜的完整性，抑制冰晶的生长，从而减少细胞内部分子的受损。
其次，海藻糖可以在冰冻之后，快速将水分子重新吸附回来，从而使细胞和组织在解冻后恢复活力和功能。
这是因为海藻糖在分子结构上具有一定的稳定性和柔韧性，能够在温度变化下保持分子链的稳定性，从而使其抗冻性更强。
综上所述，海藻糖通过调节细胞内的水分分布和稳定细胞膜的完整性，从而实现了对冰冻的抗性。
这一特性不仅有助于生物体在寒冷环境下生存，还可以为人类的冷冻保存技术、冰冻食品加工等领域提供有益的启示。
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人红细胞冰冻干燥保存研究的进展
人红细胞冰冻干燥保存研究的进展【摘要】目前红细胞临床保存方法主要有低温（4℃）和深低温（-80℃或-196℃）保存。
4℃保存时间短，而且容易受到细菌污染；深低温保存大大延长了红细胞保存时间，但需要笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。
这些缺陷限制了常规红细胞保存方法在一些特殊情况，例如在战争和自然灾害条件下的应用。
相对于常规保存方法而言，冰冻干燥具有以下优势：重量大大减轻，便于运输，适合室温保存，易于再水化。
本文就冰冻干燥保存红细胞研究的进展和所面临的挑战，尤其是最近海藻糖在冰冻干燥保存过程中的应用以及其作用机制进行了综合讨论，从而为发展一种安全、简单和有效的红细胞冰冻干燥保存方法提出理论指导。
【关键词】红细胞Progress in the Study of Lyophilization of Human Red Blood Cells ―― ReviewAbstract Now the clinical preservation methods of human red blood cells mainly include hypothermic storage (4℃) and cryopreservation (-80℃ or -196℃). The preservation time of hypothermic storage of red blood cells is relatively short and it is easy to be contaminated by microbes. Cryopreservation greatly prolongs the storage time，but it needs heavy storage equipments. Because the protective solutions in cryopreservation contain glycerol，red blood cells need complicated washing in order to remove glycerol. These shortage methods limit their application to some special conditions，such as war or natural disasters. Compared with conventional preservation methods of red blood cells，lyophilization has many advantages such as less weight，convenient transportation，room temperature preservation，prone to be rehydrated. In this review，the progress and challenge in the development of lyophilization of red blood cells，especially application of trehalose and its mechanism in the lyophilization of red blood cells were systematically discussed. This review can provide some theoretic guidance for developing a safe，simple and efficient preservation approach of red blood cells by lyophilization.Key words red blood cell；lyophilization；trehalose；biomembrane红细胞是血液中含量最多的细胞，它通过其中的血红蛋白从肺部携带氧气运送到周边器官，在维持人体正常机能起着重要的作用。
甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究
上海理工大学学报 第28卷 第5期J.University of Shanghai for Science and Technology Vol.28 No.5 2006 文章编号:1007-6735(2006)05-0413-05甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究何 晖1, 刘宝林1, 华泽钊1, 沈 敏2, 陈 颖2(1.上海理工大学动力工程学院,上海 200093;2.上海安图医院血液检验科,上海 200093)摘要:应用甘油作红细胞冷冻干燥保存的保护剂,研究甘油对红细胞的保护机制.红细胞用不同质量分数(0,20%,40%)的甘油前处理后,冻干保存前后分别检查红细胞的相关指标.结果显示,40%甘油前处理的红细胞冻干保存效果最佳,红细胞回收率和血红蛋白回收率分别达到55.3%和63.4%;红细胞渗透脆性和超氧化物歧化酶(SOD)活力与冻干保存前无明显差别.该研究为使用甘油作红细胞冻干保存的保护剂提供了实验基础.关键词:冷冻干燥;红细胞;甘油;前处理中图分类号:TS205.7 文献标识码:AG lycerol pretreatment improves the preservation qu alityof red blood cells by freeze dryingHE Hui1, LIU Bao2lin1, HUA Ze2zhao1, Shen Min2, Chen Y ing2(1.College of Power Engineering,U niversity of S hanghai f or Science and Technology,S hanghai200093,China;2.Institute of Blood Test,S hanghai A ntu Hospital,S hanghai200093,China)Abstract:Successful storage of red blood cells(RBCs)by freeze drying technique has important impli2 cations in blood transfusion and clinical medicine.G lycerol is a type of permeable intracellular lyopro2 tective agents,which can increase the concentration of cytoplasm of the red blood cells and then en2 hance the possibility of glass transition during freeze drying process.The effects of glycerol on the preservation of freeze dried human red blood cells are investigated,0%,20%and40%glycerol solu2 tions are used.The results demonstrate that glycerol has remarkable effects on the cell viability.The maximum viability of red blood cells is55.3%after pretreatment with40%glycerol solution.The re2 covery of hemoglobin is63.4%.The results provide fundamental information for long term preserva2 tion of RBCs by freeze drying.Osmotic fragility data show that glycerol exerts osmotic protection on RBCs during freeze drying.The levels of superoxide dismutase(SOD)are of no significant difference from that of fresh RBCs.K ey w ords:f reeze dryi ng;red blood cells;glycerol;pre t reat ment 收稿日期:2005-12-20 基金项目:国家自然科学基金资助项目(50376040,50576059);上海市重点学科建设资助项目(P0502);上海市引进海外高层次留学人员专项博士点资金资助项目(20050252002) 作者简介:何 晖(1977-),男,博士研究生. 红细胞保存方法有两种[1]:a.4℃冰箱保存,保存期42d以内.由于保存温度相对较高,该法存在因细菌繁殖导致血液污染的危险以及运输震荡引起溶血的问题;b.-80℃冰冻保存或-196℃深低温保存,保存期3～10a.该方法不便于运输,需要低温冰箱、液氮与杜瓦瓶等容器,操作复杂,使用前需要复温与繁琐的保护剂洗涤,难以满足大规模急救和战时的需要.这些保存方法均未解决目前红细胞保存期限或运输困难等问题,迫切需要寻找一种不受细菌与病毒污染、方便运输的长期保存方法.由于冻干制品在常温下性能稳定、便于运输,冻干保存技术已广泛地应用于生物制品、药品及食品等材料的长期保存[2].作为一种理想的保存方法,红细胞的冻干保存备受人们的关注,但该技术目前仍处于实验阶段.目前的文献大多数是从低温保存的角度研究红细胞冷冻干燥保存,这些研究使用一些常见的低温保护剂,如羟乙基淀粉、海藻糖、蔗糖及葡萄糖等进行初步实验[3～6],同时也观察了冷却速率及玻璃化的作用、干燥条件及残余含水量等对细胞膜的稳定性、蛋白质的活性的影响[7～9].但是,这些实验可重复性差,红细胞回收率均低于50%.红细胞膜是由磷脂双层、镶嵌蛋白及支撑于膜内侧的膜骨架蛋白构成,常用的冻干保护剂,如海藻糖、蔗糖不容易进入细胞膜内对细胞内物质提供保护,这是红细胞冻干保存目前无法成功的主要原因之一.甘油属于渗透型保护剂,已临床应用于红细胞的冰冻保存,而以甘油作红细胞冻干保存的保护剂尚未见成功的报道.对新鲜人体红细胞,本文初步研究了不同浓度甘油条件下红细胞回收率、血红蛋白回收率、红细胞渗透脆性以及超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化规律,为红细胞的冻干保存研究提供必需的实验基础.1 实验方法1.1 实验装置冻干保存过程分为预冻结和真空冷冻干燥过程(升华干燥和解吸干燥).预冻结过程在液氮杜瓦瓶中进行;真空冷冻干燥过程则在经改造的冻干机(Freezone2.5型,美国Labconc公司)中进行.如图1所示.该机由真空泵、干燥箱、制冷机和冷阱4大部分组成,采用复叠式制冷循环系统,冷阱温度达到-84℃,抽真空后,冻干样品可以直接在冷阱中进行干燥脱水过程,满足红细胞在一定低温下升华干燥的要求.图1 冻干机装置图Fig.1 Schematic of freeze dryer1.膨胀容器2.低温压缩机3.高温压缩机4.冷凝器5.冷凝蒸发器6.节流阀7.回热器8.真空泵9.冷阱 10.干燥箱1.2 实验材料全血取自健康志愿者静脉血(上海市血液中心提供).于4℃、1500r/min离心10min,弃上清液和白膜层;用4℃的0.9%NaCl溶液洗涤3次,收集红细胞置于4℃冰箱保存备用.使用前用等渗PBS 缓冲液(p H7.2)配制红细胞悬液(压积比40%～50%),计数,遵守无菌操作规则.1.3 主要试剂主要试剂包括聚乙烯毗咯烷酮、海藻糖、胎牛血清、柠檬酸钠(中国医药集团上海化学试剂公司)、复方甘油溶液(包含甘油57.1%、Na2HPO40.2%和KCl0.03%,上海市血液中心提供)和磷酸盐缓冲液(PBS,包含NaCl154mmol/L、KH2PO41.06mmol/ L、Na2HPO445.6mmol/L,p H7.2),实验用水采用二次蒸馏水.1.4 甘油前处理甘油前处理分为添加甘油和去除甘油两个步骤.根据甘油的质量分数w将实验分为3组. a. 0%甘油组(对照组);b.20%甘油组;c.40%甘油组.取红细胞2mL(压积比45%),缓慢滴入复方甘油液(3mL/min),滴至1/2甘油时平衡5min;甘油添加完毕后,于28℃、5%CO2培养箱(Heraeus BB K622型,美国)中平衡30min,离心去除上清液,计数.414 上海理工大学学报2006年第28卷 1.5 预冻结以超滤(使用0.22μm滤膜)过的PBS缓冲液(p H7.2)配制保护液,取前处理后的红细胞与保护液按体积比3∶7混合,保护剂终质量分数为:30%聚乙烯毗咯烷酮、20%海藻糖、15%胎牛血清和10%柠檬酸三钠),充分均匀.各取1mL样品加入安瓿瓶(2.5mL)中,计数(作为冻干前细胞数),检测血红蛋白浓度及相关指标;4℃下平衡20min后,快速置入升降式程序降温仪(本所自制)的样品盘中,以-5℃/min的速率降温至-70℃,在此温度下保持1.5h后快速置入冻干机中.每组实验重复5次.1.6 冻干实验升华干燥依次控制搁板温度-60℃和-35℃,各持续12h;解吸干燥控制搁板温度+20℃,持续10h,真空度低于10Pa.冻干过程结束后,剩余含水量低于3%.将样品放入真空密封袋,并置入干燥皿中保存.1.7 复水红细胞冻干保存后直接用等渗溶液复水,对红细胞有很大的损伤,溶血率高达85%[4],可以采用分步复水使红细胞渗透压逐步恢复至等渗.采用6%NaCl、3%NaCl和0.8%NaCl加2%葡萄糖溶液分步复水后,制备成与冻干保存前同体积的红细胞悬液,计数(作为复水细胞数),检测复水后血红蛋白浓度及相关指标.1.8 检测指标与方法1.8.1 红细胞回收率红细胞冻干保存前后,用自动血细胞分析仪(Beckman Coulter Ac T5diff,美国)计数[5],红细胞回收率a(%)为a=bc×100%(1)式中 b———复水细胞数 c———冻干前细胞数1.8.2 血红蛋白回收率用自动血细胞分析仪检测冻干保存前后血红蛋白浓度,血红蛋白回收率d(%)为d=ef×100%(2)式中 e———复水后细胞血红蛋白浓度 f———冻干前细胞血红蛋白浓度1.8.3 红细胞渗透脆性试验[10]配制不同渗透压的低渗NaCl溶液,在6个盛有4.5mL NaCl溶液试管中分别加入20μL红细胞,静置30min后,2000r/min离心20min,使用分光光度计(UV9100型,日本岛津)在540nm测上清液的光吸收度.以对照样加入0.9%NaCl管的上清液为空白对照(光吸收度为A0),以对照样加入蒸馏水管的上清液为全溶血对照(光吸收度为A100),根据各管上清液的光吸收度A,按式(3)计算红细胞的溶血率H(%),并由此作出冻干前后红细胞溶血率氯化钠质量浓度关系的曲线.H=A-A0A100-A0×100%(3)1.8.4 超氧化物歧化酶(SOD)活力检测用黄嘌呤氧化酶法检测红细胞超氧化物岐化酶(SOD)的活力,按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)的说明书方法操作,酶活力单位用U/g Hb (Hemoglobin,Hb)表示.1.9 统计分析统计学分析实验数据以平均值±标准偏差表示,以Windows Excel2003软件采用t检验比较各组差异.图2 复水后红细胞形态(×400)Fig.2 Micrograph of freeze dried RBCs after rehydration 2 结 果2.1 光学显微镜检查冻干保存过程红细胞一般受到冰晶损伤、溶质损伤和干燥脱水损伤,同时在复水过程中,干燥红细胞也容易受到复水液渗透压的冲击,使细胞膜结构受到损伤.将干燥红细胞依次在不同渗透压的溶液中平衡后,逐渐恢复到等渗状态,可以减小渗透压变化对细胞膜的损伤.从图2可以看出,干燥红细胞复水后经光学显微镜观察,发现红细胞的体积变化不大,结构保持完整,表面均呈凹状,与新鲜红细胞的514 第5期何 晖,等:甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究 外观特征一致.2.2 不同浓度甘油红细胞回收率的变化不同浓度甘油对红细胞回收率的影响,如图3所示.对照组的红细胞回收率低于35%,与20%甘油组无明显差别(统计误差P>0.05),而40%甘油组的红细胞回收率达到55.3%,明显高于前两组(P<0.01).图3 甘油前处理质量分数与红细胞回收率的关系(0%表示对照组)Fig.3 E ffect of concentrations of glycerol on the viabilityof freeze dried RBCs after rehydration2.3 不同浓度甘油血红蛋白回收率的变化不同浓度甘油对血红蛋白回收率的影响,如图4所示.对照组与20%甘油组无明显差别,而40%甘油组的血红蛋白回收率明显高于20%甘油组(P<0.01),达到63.4%.图4 甘油前处理质量分数与血红蛋白回收率的关系(0%表示对照组)Fig.4 E ffect of concentrations of glycerol on the recoveryof hemoglobin in freeze dried RBCs afterrehydration2.4 不同浓度甘油红细胞渗透脆性的变化复水前后红细胞溶血率氯化钠质量浓度的变化曲线如图5所示.曲线右移,说明某一氯化钠质量浓度ρ下红细胞(RBC)的溶血率上升,RBC的抗渗透破碎能力下降,渗透脆性增加.由图可见,新鲜红细胞与40%甘油组的曲线基本重合,说明40%甘油组的红细胞渗透脆性与新鲜红细胞相比变化不大;对照组与20%甘油组的曲线明显右移,各氯化钠浓度下的溶血率与新鲜红细胞比较有明显差别(P<0.05),说明红细胞渗透脆性增大.图5 甘油前处理浓度对红细胞渗透脆性的影响Fig.5 The osmotic fragility curve of freeze driedRBCs after rehydration2.5 不同浓度甘油超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化 不同浓度甘油对超氧化物歧化酶(SOD)活力γ影响,如图6所示.对照组与20%甘油组无明显差别;40%甘油组超氧化物歧化酶(SOD)活力与新鲜红细胞相比无明显差别(P>0.05),明显高于20%甘油组与对照组(P<0.01).图6 甘油对超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响(0%表示对照组)Fig.6 E ffect of concentrations of glycerol on activityof SOD in freeze dried RBCs after rehydration3 讨 论自20世纪90年代初,人们开展具有重要现实意义的红细胞冻干保存研究.1999年,Rindler等[7] 614 上海理工大学学报2006年第28卷 报道使用200℃/min以上的冷却速率对红细胞冷冻后于-80℃下真空冷冻干燥,复水后红细胞回收率不超过30%.目的使红细胞溶液形成玻璃态,降低冰晶形成和溶质浓缩对红细胞的损伤,但无法避免快速冷却过程中胞内冰形成对红细胞的损伤.此后的研究认为,红细胞的冻干保存与其低温保存一样,需要在细胞内添加合适的保护剂[11].2001年, Willem等[12]报道用人工方法将海藻糖载入血小板中,冻干保存后血小板的回收率达到85%.2004年,Gyana等[13]研究海藻糖载入红细胞的方法与载入效果,认为海藻糖是适合红细胞冻干保存的胞内保护剂.但由于海藻糖分子量大,不容易透过细胞膜,因此,其应用受到限制.甘油系细胞内冷冻保护剂,分子量小,易于透过细胞膜进入红细胞内.甘油作为冷冻保护剂已广泛应用于红细胞的低温保存,使用40%甘油对红细胞进行冰冻保存取得较好效果[14],本文对甘油作红细胞冻干保存的保护剂进行尝试有一定意义.研究初期尝试直接使用高质量分数(40%)甘油作保护剂,结果解吸干燥阶段出现起泡、融解等不正常现象,复水后大量溶血.此后在预冻结前用甘油对红细胞前处理,以期增加细胞内甘油浓度并降低胞外甘油浓度,有利于冻干过程的正常进行.本文对冻干保存红细胞不仅检测红细胞回收率指标,而且检测了血红蛋白回收率、红细胞渗透脆性与超氧化物歧化酶(SOD)活力3项指标,以期更全面地探讨甘油对冻干保存红细胞功能变化的影响.结果发现,经40%甘油前处理后,红细胞回收率明显提高,达到55.3%,高于目前文献报道的红细胞回收率[7,8],血红蛋白回收率达到63.4%,渗透脆性、超氧化物歧化酶(SOD)活力与新鲜红细胞之间无明显差别.其中,渗透脆性是反映红细胞骨架系统稳定性的重要参数,这一结果表明甘油在冻干过程中对红细胞膜有明显的保护作用.甘油对红细胞的冷冻和干燥保护机制可能为:甘油本身具有较强的亲水特性及氢键形成能力,在细胞内部,甘油可以羟基与水分子结合,减少游离水而抑制冰晶分子的形成,从而减少冰晶分子对细胞的机械性损伤和渗透压改变对细胞的化学损伤[1];同时增加了胞内溶液浓度,在干燥脱水过程中易形成玻璃态的程度;其次利用它们的羟基与水分子结合,在细胞膜外形成一个稳定的水分子层,使细胞膜内的水分在冷冻过程迅速进入过冷状态而不结冰,干燥过程又不易向外转移,保护了细胞的结构.但今后仍需进一步研究其对红细胞的干燥脱水保护机制以及复水过程中红细胞的损伤防护机制,逐步建立一套有效和操作简便的红细胞冻干保存方法,为进一步的红细胞冻干保存研究提供依据.参考文献:[1] 华泽钊,任禾盛.低温生物医学技术[M].北京:科学出版社,1994.[2] 华泽钊.冷冻干燥新技术[M].北京:科学出版社,2005.[3] G OODRICH R P.Lyophilization of red blood cells[P].United States Patent:4874690,1989.[4] TOMETSKO N M.Method and composition forlyophilizing red blood cells[P].United States Patent,5750330,1998.[5] SPIEL ES G,HESCHEL I,RAU G.An attempt to re2cover viable human red blood cells after freeze drying[J].Cryo Letter,1996,17:43-52.[6] WEINSTEIN R,SOWEMIMO CO KER S O,G OODRICH R P.Survival of lyophilized and reconsiti2tuted human red blood cells in vivo[J].Transfus ClinBiology,1995,2(6):427-432.[7] RINDL ER V,LΒN EBER GER S,SCHWIND KE P.Freeze drying of red blood cells at ultra low tempera2tures[J].Cryobiology,1999,38(1):2-15.[8] RINDL ER V,HESCHEL I.Freeze drying of redblood cells:how useful are freeze/thaw experiments foroptimization of the cooling rate?[J].Cryobiology,1999,39(3):228-235.[9] DUNCAN Q M,CRAIG P,RO Y ALL G,et al.Therelevance of the amorphous state to pharmaceuticaldosage forms:glassy drugs and freeze dried systems[J].International Journal of Pharmaceutics,1999,179(2):179-207.[10] 柏乃庆.血液保存[M].上海:上海科技出版社,1984.[11] CHEN T,ACKER J P,ERO G LU A,et al.Beneficialeffect of intracellular trehalose on the membrane integri2ty of dried mammalian cells[J].Cryobiology,2001,43(2):168-181.[12] WOL KERS W F,WAL KER N J,TABL IN F,et al.Human platelets loaded with trehalose survive freezedrying[J].Cryobiology,2001,42(2):79-87. [13] SA TPA THY G R,ZSOL T T,RACHNA B,et al.Load2ing red blood cells with trehalose:a step towards biostabi2lization[J].Cry obiology,2004,49(2):123-136. [14] MER YMAN H T.Cryoprotective Agents[J].Cryobiol2ogy,1971,8(2):173-183.714 第5期何 晖,等:甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究 。
海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究(一)
海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究(一)作者：崔云，刘璐，黄成垠，尹其华,黄鹰〔摘要〕目的：研究海藻糖对液态低温（4℃）保存血小板的保护作用。
方法：采集兔心脏血，按常规方法制备浓缩血小板（CP），在CP中加入不同浓度的海藻糖，4℃储存，用51Cr铬酸钠进行标记后自体回输入兔体内，于回输后1、24、48、72h抽取兔耳动脉血，测定放射性计数率，计算24、48、72h血小板存活率，同时设常温对照组及单纯4℃储存的低温对照组进行比较。
结果：加入不同浓度海藻糖各储存组的血小板寿命明显长于低温对照组，并且随着海藻糖浓度的增加而延长。
结论：海藻糖可延长4℃液态保存血小板的寿命，对血小板具有保护作用。
〔关键词〕海藻糖；血小板；液态；储存；4℃；51铬Abstract：ObjectiveTostudytheprotectionoftrehaloseforliquidrabbitplateletsstoredat4℃tracedby51Cr.Meth odsCardiacbloodwastakenandmadeintoconcentratedplatelet(CP).CPwerestoredatdifferentconditi ons,suchaslowtemperatureandlowtemperature+differentdoseoftrehalosefor24h.Plateletsweretra nsfusedintorabbits’bodiesafterbeinglabelledwith51Crandplateletlifespanof24,48,72hwascalculate d.ResultsAftertrehalosewasaddedintotheplateletsstoredat4℃,thelifespanwasobviouslylongertha nthatofplateletsstoredatlowtemperature.Andwiththedoseincreasing,thelifespanofplateletswespr olongedobviouslytillthedosewasmorethan50mg・ml-1.ConclusionTrehalose，protectingplatelets,canprolongthelifespanofliquidplateletsstoredatlowtemperature. Keywords：trehalose;platelet;liquid;storage;4℃;51Cr海藻糖对液态低温保存血小板保护作用的实验研究在对大量失血和化疗、放疗等处理造成血小板减少患者的治疗过程中,需要进行血小板输注。
生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用
生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用【摘要】 海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖～在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并已广泛应用于人血细胞的冻干。
海藻糖以其异常的水合能力、独特的玻璃化转换和晶体转变行为及抗高温潮湿的特性受到密切关注～并成为细胞保存研究中首选的一种保护剂。
海藻糖对细胞的保护机制、海藻糖导入哺乳细胞的实验方法以及红细胞对海藻糖负载的可能作用机制都是近几年细胞保存研究的热点～本文就以上几方面的进展详细进行论述。
【关键词】 生物膜保护剂,海藻糖, 冻干保存,红细胞Trehalose —A Biomembrane Protectant Applyied to Lyophilization of Human Red Blood Cells——ReviewAbstractTrehalose, as a nonreducing disaccharide, plays a role in protecting the cytoactivity when the cells is freezing, drying or lyophilization. It has been a biomembrane protectant applied to lyophilization of human blood cells (platelets and erythrocytes), and from which astonishing results have been obtained. Having powerful hydration, distinctive vitrification transform and crystal transform and unique resistance of high temperature and humidification,trehalose is thought of a preferred protectant in the study of cell preservation. In recent years, people concerned trehalose on its protective mechanism, experimental means of transit trehalose to mammal cells and the mechanism of loading in red blood cells. The above aspects were briefly summarized in this article.Key wordstrehalose, vitrification, lyophilization, erythocyte海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖～在一些微生物、低湿休眠脊椎动物和更苏植物中有较高的浓度。
异麦芽酮糖醇和海藻糖_概述及解释说明
异麦芽酮糖醇和海藻糖概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文旨在对异麦芽酮糖醇和海藻糖进行全面概述及解释说明。
异麦芽酮糖醇和海藻糖是当今食品工业中备受关注的两种天然甜味剂。
这两种甜味剂在结构、生产方法、应用领域以及健康影响等方面存在差异。
通过本文的介绍，读者将能够全面了解异麦芽酮糖醇和海藻糖的定义、特点、来源以及各自的应用领域。
1.2 文章结构本文首先对异麦芽酮糖醇进行详细介绍，包括其定义和特点以及常见的生产方法。
接着，我们会探讨异麦芽酮糖醇在不同行业中的广泛应用领域。
随后，我们将转入对海藻糖的说明，包括其定义和特点，以及海藻糖的来源和营养价值。
当我们理清楚海藻糖的基本知识后，我们也将深入探讨海藻糖的应用领域。
最后，我们将进行异麦芽酮糖醇和海藻糖的比较，主要关注它们在结构上的差异、工业应用的对比以及对人体健康产生的影响等方面。
1.3 目的本文的目标是让读者全面了解异麦芽酮糖醇和海藻糖这两种甜味剂，并对其在食品工业中的应用有一个清晰的认知。
通过介绍它们的特点、来源和营养价值，读者将能够更好地理解这两种甜味剂在各自领域中所起到的作用。
此外，通过对它们进行比较分析，读者还能够了解它们之间在结构、工业应用和健康影响方面存在何种差异。
本文旨在为读者提供一个全面详尽、清晰易懂的信息来源，使他们能够更好地理解和运用这两种天然甜味剂。
2.异麦芽酮糖醇2.1 定义和特点异麦芽酮糖醇，也被称为异麦芽糖醇或异麦芽精，是一种天然甘味剂。
它是由葡萄糖经过发酵、水解和精制得到的白色结晶性粉末。
异麦芽酮糖醇具有甜味，并且与蔗糖相比，其能量密度更低，不同于蔗糖会引起血糖水平显著波动。
2.2 生产方法异麦芽酮糖醇的主要生产方法包括以下几个步骤：首先，在大豆或玉米中加入一种特定菌株进行液态发酵，使其转化为多元糖；然后通过水解将多元糖转化为分子量较小的低聚果糖；最后进行结晶和纯化处理得到纯度较高的异麦芽酮糖醇。
2.3 应用领域异麦芽酮糖醇在食品工业中具有广泛的应用。
海藻糖+甘油 - 安全、无毒的干细胞冷冻保护剂
海藻糖+甘油 | 安全、无毒的干细胞冷冻保护剂创面愈合是一个动态、复杂的病理过程，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质、神经以及血管之间的相互协调。
脂肪来源干细胞（ADSCs）属于成体间充质干细胞的一种，可通过旁分泌多种细胞因子促进胶原沉积、组织血管化，并参与免疫调节机制，促进创面愈合。
此外，脂肪来源干细胞可分化成上皮细胞，角质形成细胞和真皮成纤维细胞，直接促进创面愈合。
脂肪来源干细胞通常需要通过外科手术获取，但随着供者年龄的增大，脂肪来源干细胞的多向分化潜力会显著降低。
假设可以对单次手术获取的年轻供者的脂肪来源干细胞冷冻保存，之后按需多次取用，就可以显著降低患者的治疗费用，同时降低干细胞供者年龄对治疗效果的影响。
该研究采用小鼠背部创面模型，对经过冻存复苏的脂肪来源干细胞和新鲜脂肪来源干细胞作用差异进行比较。
结果显示，经过复合型CPA冻存复苏后的脂肪来源干细胞表现出与新鲜干细胞相同的促进创面愈合能力，1.0 mol/L海藻糖+20%甘油作为复合型冻存保护剂冻存脂肪来源干细胞，不会影响干细胞的体内生物学功能。
复合型冷冻保护剂可通过不同机制在冷冻过程中互补。
海藻糖作为一种非渗透性冷冻保护剂，分子量相对较小，可在细胞表面形成保护膜，减少对细胞的冷冻损伤。
然而，海藻糖不能渗透细胞膜，限制了其保护效率。
甘油作为渗透性冷冻保护剂，通过增加溶液黏度，减少冰晶形成等方式起保护作用，同时，甘油可以帮助海藻糖穿透细胞膜以提高海藻糖的功效。
该研究表明，海藻糖+甘油作为一种安全、无毒的复合型冻存保护剂，不仅实现了脂肪来源干细胞活性的高效保存，还有效的保护了其生物学功能，确保其冻存复苏后具有与新鲜干细胞相同的促进组织再生效果，是一款ji具临床转化前景的生物安全型干细胞冷冻保护剂。
红细胞冷冻干燥保存研究进展
红细胞冷冻干燥保存研究进展随着临床成分输血技术的推广及成熟，红细胞保存方法的研究倍受关注及重视。
目前红细胞的常规保存方法主要有液体保存法（4℃）和深低温保存法（-80℃或-196℃）。
液体保存法（4℃）保存时间短，最长只能有效延续至42天,而且容易受到细菌污染；深低温保存（-80℃或-196℃）可长期保存，但需要昂贵、笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。
而冷冻干燥保存法以其重量大大减轻、便于运输、适合室温保存、易于再水化等优势备受关注。
本文就红细胞保存的相关理论及冷冻干燥法保存红细胞研究的进展及所面临的挑战进行讨论，从而为发展一种安全、简单和有效的红细胞冷冻干燥保存方法提供理论指导。
标签：红细胞保存冷冻干燥红细胞的主要成分是血红蛋白,它是抢救危重失血病人的直接、有效手段。
目前在实际工作中使用红细胞的保存方法虽然都有一定的保存效果，但也存在明显不足，严重限制了常规保存方法在恶劣自然条件或战时条件下的应用[1]。
相比而言，冷冻干燥保存的红细胞具有明显的优势，因此，红细胞冷冻干燥保存技术的研究一旦成功，极大改善特殊状况下血液的供应状况，开创血液供应的新时代。
人们通常把血液保存在液体基质中红细胞会发生一系列的生物化学与结构上的改变称为红细胞损伤[2]。
这些损伤也是影响输血后红细胞生存与功能改变如携氧能力的主要原因。
通常衡量血液是否合格标准，是看输入24h以后，其存活的红细胞能否达到输入量的70% ，如能达到70% 即为合格，而保存这些红细胞的时间称为保存期[3]。
因此，红细胞的存活率是血液保存期的衡量指标。
由于红细胞的成分主要是血红蛋白，血液保存期间,如果红细胞损伤，红细胞膜破裂,血红蛋白即会大量从红细胞内逸出。
因此红细胞变形指数（EI）和平均红细胞体积（MCV）也是反映保存效果的重要指标[4]。
红细胞的冷冻干燥保存过程主要由深低温保存和抽真空干燥两个环节组成，在此过程中红细胞既要经受冷冻的打击，又要受到干燥的损伤，其中后一环节对红细胞损伤占有主要地位[5]。
海藻糖在冻干保护中的应用
海藻糖在冻干保护中的应用1. 引言慢病毒载体（Lentiviral Vector，LV），基于人类免疫缺陷型病毒（HIV）发展，不但对分裂细胞，而且对非分裂细胞都具有侵染本领。
它能在体内长期稳定地表达基因，因此在肿瘤免疫的过继性细胞疗法中，特别是TCR—T和CAR—T细胞疗法中得到了大面积应用。
其中，慢病毒载体在CAR—T细胞的生产环节中起到关键作用，通过携带目的基因的慢病毒载体侵染T细胞。
而慢病毒的滴度，直接关系到侵染是否成功，是这一过程中的关键因素。
然而，慢病毒载体由蛋白质和核酸构成，这使得其储存条件面对与其他生物制品仿佛的挑战。
例如，它通常无法在常温或4℃冷藏条件下长时间保管，热稳定性差，且反复冻融会降低其滴度。
目前，尚无理想的慢病毒载体冻存保护液，即使采用—80℃冷冻保管或加入甘油保护剂，也无法有效防止慢病毒载体在储存过程中滴度降低。
另外，慢病毒载体的运输需要低温冷链，这无疑加添了运输本钱，且无法百分之一百躲避运输带来的风险。
因此，找寻一种有效的保护剂和储存方法，以稳定慢病毒载体的滴度并简化其运输过程，成为了亟待解决的问题。
这其中，海藻糖作为良好的冻干保护剂，凭借其特别的分子结构和理化性质，呈现出巨大的应用潜力。
2. 研究分析华东师范高校沈鸿伟等在慢病毒载体冻干制剂的制备及稳定性研究中发现，海藻糖作为一种良好的冻干保护剂，在制剂制备及稳定性方面发挥了紧要作用。
这项研究为生物医药制剂等相关领域供应了新的思路和方法，进一步推动了海藻糖在慢病毒载体冻干制剂制备中的应用。
海藻糖在冻干保护中的优势在于其特别的分子结构和理化性质。
海藻糖是一种非还原性双糖，具有较好的热稳定性、吸湿性和结晶性。
在冷冻干燥过程中，海藻糖可以有效地保护生物分子和细胞免受损伤，同时还可以抑制冰晶的形成，减少干燥过程中细胞的分裂。
另外，海藻糖还具有良好的化学稳定性和生物相容性，可以与多种药物和生物分子结合，提高制剂的稳定性和有效性。
红细胞保存期对冻干前海藻糖负载量的影响研究
２ 、８和 ７ ４４ ２ｈ的红细胞在 海藻糖浓度 ８０ｍ ｏ Ｌ的负载缓冲液 中孵育 ７ｈ后 ， 测胞 内海藻糖浓度和胞外外游离血红蛋 白浓 ０ ｍ ｌ ／ 检
度 。 经 相 同条 件 孵 育 后 ， 组 红 细 胞 对 海 藻 糖 的 摄 取 量 基 本 相 同 ， 别 为 （ ９７ ７± ：５ ） （ ０ ３６± ． １ ） （ ９７ ８± ４ 分 ４ ．４ ２ ２ ３ 、 ５ ． １ ０ ６ ２ 、 ４ ． ６
酸一 酮试剂 ： ９ ％浓硫 酸缓缓加 入到蒸 馏水 中配 蒽 将 ８ 制成 ８ ％硫 酸溶液 。取分析 纯蒽酮 ０ ２ｇ ８ ％硫 ０ ． 加 ０
酸溶液 １０ｍ ０ Ｌ使溶 解 、 匀 ， 前 配制 。色 原缓 冲 摇 用
液 ： 酚 ４ ７ 、一 基 比林 ０ ５ｇ 苯 ． ５ｇ４氨 ． 溶解 于 ０ １ｍ ＬＬ ． ｏ／
（ 京 化 工 厂 ） 蒽 酮 （ 京 金 龙 化 学 试 剂 公 司产 北 ， 北 品 ） 磷 酸盐缓 冲盐 水 （ Ｂ ） ３０ ｍＯ ｍ，ｐ ． ） ， Ｐ Ｓ （０ ｓ Ｈ７ ２ ：
１ ４ ｍｍｏ ａ Ｉ １ ０ ５ ｌ Ｎ Ｃ ， ． ６ ｍｍｏ ｌ ＫＨ２ Ｏ ４和 ５ ６ ｍｍｏ Ｐ ． ｌ
医药卫生
红 细 胞保存 期对 冻干 前海 藻糖 负载量 的影 响研 究
庄 远 刘 景 汉 吕 颖 陈麟 凤 薛英 娜
（ 解放军总医院输血科全军 ｆ床输血中心 ， Ｉ 缶 北京 １０ ５ ） ０ ８３
摘 要
探讨冻干前红细胞保存期对海藻糖 负载量的影响 ， 定红细胞负载海 藻糖 的最佳条件。在 ３ ℃条件 下，￣ 确 ７ ４Ｃ保存 ０ 、
ｙ ａ ｕ ｎ １ ＠ ｈ ｔ ｉ． ｏ ｕ ｎｙ ａ ０２ ５ ｏｍａｌ ｃ ｍ。
联合海藻糖和二甲基亚砜进行冻干前负载的人红细胞冻干效果研究
第２ ｌ期
２０ ０ ８年 １ １月
科
学
技
术
与
工
程
Ｖ０ ＿ Ｎｏ ｌ８ ．２１
ＮＯ ２ ８ Ｖ． ０ｏ
１７ —８９ ２０ ） １５ ８ —６ ６ １１ １ （０ ８ ２ —７７ ０
Ｓ ｉｎｃ ｃ ｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅｎｇｎ ｅ ｉ ｇ ｃｅ ｅ Ｔｅ ｈｎ ｌｇ ｎ ｉｅ ｒｎ
于 两组 负载 缓 冲 液 ，７ 孵 育 ８ｈ后 离 心 去 除上 清 ， 入 冻 干 保 护 剂 混匀 后 程 序 冻 干 ，５ Ｐ Ｐ溶 液 ３ ℃ 三 步 复 水 。分 别 检 测 ３℃ 加 １％ Ｖ ７
并比较两组冻干红细胞复水后血红蛋 白回收率 、 复水红 细胞 变形性 、 再水化 后 ４Ｃ放置时 间对 冻干红 细胞再 水化稳 定性 的影 ￣
８０ ｍ ｌＬ Ｄ Ｏ的添加 浓 度 为 ６ ， 用 新 鲜 红 ０ ｍｏ 、 ＭＳ ／ ％ 采
细胞 ， ３ ￣ 件 下 经 负 载缓 冲 液孵 育 ８ｈ 在 ７Ｃ条 。红 细 胞在 冻干 前 经 细胞 非 渗透 性 保 护 剂 海 藻 糖 和 渗 透
对 细胞生 物膜 、 白质 和 核 酸 等生 物 大 分 子 良好 的 蛋 保 护作用 ， 者 在 以前 的实 验 研 究 中 ， 取 海 藻 糖 笔 选
第一 作 者 简 介 ：庄 远 ，主 治 医 师、博 士 研 究 生 。 Ｅｍａ ： ． ｎ ２１ ＠ ｏ ｍａ ． ｏ
摘
要
探讨人红细胞在冻干前经添加低 浓度 二 甲基 亚砜（ ＭＳ 海藻糖 负载缓冲 液负载 后， 否会提 高红 细胞 的冻干效 Ｄ Ｏ） 是
果。实验组 ： ６ ＭＳ ８０ｍｍ ｌＬ海藻糖。对照组： 为 ％Ｄ Ｏ＋ ０ ｏ ／ 冻干前 负载缓冲液为等渗 Ｐ Ｓ Ｂ 。取 等量压积红 细胞（ ６份 ） 分别重 悬
海藻糖在细胞冻存的作用
海藻糖在细胞冻存的作用细胞冻存是一种常见的细胞保存方法，它可以将活细胞在极低温下保存起来，以便日后使用。
在细胞冻存过程中，海藻糖被广泛应用于细胞保护剂的制备中，起到了非常重要的作用。
本文将重点介绍海藻糖在细胞冻存中的作用及其机制。
一、海藻糖的保护作用海藻糖是一种天然的二糖类物质，具有优秀的保护细胞的能力。
它可以通过一系列的机制来保护细胞免受低温冻结和解冻过程中的损伤。
海藻糖可以降低细胞的冻结点。
在低温下，细胞内的水分子会形成冰晶，导致细胞脱水和机械损伤。
海藻糖通过与水分子结合，减少了水分子的可用数量，降低了细胞的冻结点，避免了细胞的脱水和机械损伤。
海藻糖可以稳定细胞膜的结构。
低温条件下，细胞膜的流动性降低，易受损。
海藻糖能够与细胞膜脂质相互作用，增加细胞膜的稳定性，保持其完整性，防止细胞膜的破裂和溶解。
海藻糖还可以减少冷冻解冻过程中的冷冻损伤。
冷冻解冻过程中，细胞内外温度的突然变化会导致细胞内外渗透压的不平衡，进而引起细胞的溶胀和溶解。
海藻糖可以维持细胞内外渗透平衡，减少细胞的溶胀和溶解，降低冷冻解冻过程对细胞的损伤。
二、海藻糖在细胞冻存中的应用海藻糖在细胞冻存中的应用主要包括冷冻保护剂的配制和细胞冻存液的制备。
在冷冻保护剂的配制中，海藻糖通常与其他保护剂如甘油、蔗糖等混合使用，以增强细胞的保护效果。
海藻糖的添加浓度一般在0.1-0.5 M之间，具体的浓度要根据细胞类型和冻存条件来确定。
在细胞冻存液的制备中，海藻糖通常被加入到冻存液中作为保护剂。
冻存液的配方可以根据具体需要进行调整，但海藻糖的添加是必不可少的。
海藻糖可以提供足够的保护，保持细胞的完整性和活力，在细胞冻存过程中起到重要的作用。
三、海藻糖的机制研究海藻糖在细胞冻存中的作用机制一直是科学家们关注的研究领域。
通过对细胞和海藻糖相互作用的研究，科学家们发现，海藻糖与细胞膜脂质、蛋白质和核酸等分子之间存在着多种相互作用。
海藻糖可以与细胞膜脂质相互作用，增加细胞膜的稳定性，减少膜脂质的液晶到凝胶相变，从而保护细胞膜的完整性。
海藻糖的作用与功效
说到海藻糖这种新型天然糖类，相信很多人并不觉得陌生，因为我们日常生活中食用的大多食物都含有海藻糖这种糖类，海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，从而维持生命体的正常生存，能够保护其在恶劣环境的物种不受到侵害。
那么它的作用和功效是什么我们来一起了解一下。
其实海藻糖的作用和功效是非常多的，而且应用同样也是非常的广泛，例如：一些烘烤类制品，糖果类食品等等都含有这类的天然糖。
海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。
1.食品工业海藻糖在食品工业中的应用：与其它糖类一样，海藻糖可广泛应用于食品业，包括饮料、巧克力及糖果、烘烤制品和速冻食品。
烘烤制品类：在烘烤制品中,海藻糖有多种潜在的使用价值：它能调节蛋糕、饼干和糕点上的糖霜、面包奶油和水果馅的甜味与芳香，不损害贮藏寿命，使人们品尝到产品原有的风味。
糖果类：海藻糖与其它大多数增甜剂混合，可在糖果、果汁饮料和药草产品中使用，以调节产品甜质，从而能真正保持产品的原有风味。
另外，由于海藻糖性质的稳定性，不会产生水解，产品色泽不变并保持原有光泽。
速冻品类：海藻糖可代替蔗糖，降低冰淇淋和其他冷冻制品的凝结点。
可在冻品和冰冻糖果中用于产生新的糖霜，并产生独特的可口的风味。
2.医药工业海藻糖在医药工业中的应用：(1)在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。
(2)英国剑桥的Quadrant研究基金会将小儿麻痹症疫苗与海藻糖混合冻干后，发现在干燥状态下45℃时其稳定性和液态4℃保存条件时相当。
(3)美国加利福尼亚大学的约翰克劳及其同事将海藻糖与制造血小板的细胞混合，经干燥脱水使细胞变干后，将其冻干在室温下可长时间保存。
人血小板的冷冻干燥保存：细胞内外保护剂的作用
关键词 生物物 理学；血小板 ；冷冻 干燥 ；海藻糖
பைடு நூலகம்
中图分类号：Ｑ ５Ｔ ０ ８ ６ ； Ｑ ２． ３ ６
文献标识码：Ａ
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文章编号 ：０５ －３９２ ０）２０ ３－５ ２３４ ３ （０８０－ ０３ ０
人血小板 的冷冻干燥保存 ：细胞 内外保护剂的作用
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海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制
海藻糖蔗糖mrna-lnp冻干保护机制
海藻糖和蔗糖在mRNA-LNP冻干保护机制中起到关键作用。
这两种糖类物质具有相似的冻
干保护效果，但具体机制略有不同。
以下是海藻糖和蔗糖在mRNA-LNP冻干保护机制中的
作用：
1. 防止冰晶形成：海藻糖和蔗糖都能降低水相的结晶温度和结冰量。
在冻干过程中，它们可以防止冰晶对mRNA-LNP结构造成破坏。
2. 保护剂作用：海藻糖和蔗糖作为保护剂，可以吸附在油水界面形成的界面膜上，增大空间位阻，降低脂质纳米颗粒（LNP）之间的相互作用。
此外，它们还可以减少膜融合、保护脂质体粒子不在冻干过程中破裂、泄露药物。
3. 调节渗透压：蔗糖在冻干制剂中可以调节渗透压，有助于维持mRNA-LNP的稳定性。
而海藻糖在这方面的作用相对较弱。
4. 性价比：与甘露醇、葡萄糖等相比，蔗糖具有较高的玻璃化转变温度和粘度，保护效果更好。
同时，蔗糖的性价比更高，因此在mRNA-LNP冻干保护中得到广泛应用。
5. 复溶稳定性：使用海藻糖或蔗糖作为冻干保护剂的mRNA-LNP制剂，在复溶后药液
稳定性和复溶效果（主要是药物包封率和粒径变化）方面都有很好的表现。
综上所述，海藻糖和蔗糖在mRNA-LNP冻干保护机制中起到关键作用，通过防止冰晶形成、保护剂作用、调节渗透压、性价比和复溶稳定性等多方面保证mRNA-LNP疫苗的质量和稳
定性。
在实际应用中，根据具体需求和实验条件，可以选择适合的糖类物质作为冻干保护剂。
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海藻糖在血细胞冻干保存中的应用石 釧1,韩俊领1,2(1.协和干细胞基因工程有限公司,天津300384; 2.中国医学科学院、北京协和医学院,血液学研究所,血液病医院,天津300020)中图分类号:R457.1 文献标识码:A 文章编号:100622084(2008)1922908204 摘要:海藻糖是目前血细胞冻干保存中最常用的保护剂,作为一种稳定的非还原性双糖,它在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并显露出在血细胞冻干保存中的广阔应用前景。
本文主要就冻干对血细胞损伤机理,海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状进行综述。
关键词:海藻糖;冻干保存;血细胞Appli ca ti on of Treha lose i n L yoph ili za ti on of Blood Cells SH I Chuan1,HAN Jun2L ing1,2.(1.U2 nion S te m Cell&Gene Engineering L i m ited Co m pany,Tianjin300384,China;2.Institute of He m atolo2 gy and B lood D isease Hospital,Peking U nion M edical College,Chinese A cade m y of M edical Sciences, Tianjin300020,China)Abstract:Trehal ose is regarded t o be a p referred p r otectant for lyophilizati on of bl ood cells.Treha2 l ose,as a nonreducing disaccharide,p lays a r ole in p r otecti on of the cyt oactivity when the cells is freez2 ing,drying or lyop ilizati on,and shows br oad app licati on p r os pect on lyophilizati on of bl ood cells.This paper revie wed the da maged effect of lyophilizati on on bl ood cells,the mechanis m of trehal ose p r otec2 ti on and the experi m ental studies on trehal ose.Key words:Trehal ose;Lyophilizati on;B l ood cells 目前,红细胞、血小板和造血干细胞的保存仍主要采用常温下短期保存和深低温下长期保存两种方法。
均存在需要笨重存储设备、保存费用昂贵、运输不便等限制,远远不能满足临床应用。
由于冻干血细胞能在常温下保存,保存时间长,性能比较稳定,输注方便,保存费用低廉,便于运输等优点,尤其能够满足战时需要,血细胞的冻干保存已成研究热点。
血细胞的冷冻干燥过程一般包含预冻、初级干燥、次级干燥3个步骤。
在此过程中,细胞的生存条件、物理状态均发生变化,构成细胞的膜蛋白及磷脂存在一定程度的变性,影响细胞器的功能活动,细胞的生活力下降。
如何最大限度的抑制细胞成分的变性,保持细胞原有的活力,一直是血细胞冻干保存研究的重点。
海藻糖是一种非还原性双糖,在自然界广泛存在,由于其具有在脱水、干旱、高温、冷冻及高渗透压等严酷环境条件下保护生物体的组织和大分子的功能,引起了人们的广泛关注[1,2]。
近年研究显示,海藻糖是低温生物领域最佳的保护剂。
现就海藻糖在血细胞冻干保存中的作用机制及应用现状综述如下。
1 冷冻干燥对血细胞的损伤机制在液体冷冻保存中时,血细胞冷冻过程的损伤主要是由机械效应和溶质效应引起。
血细胞在预冻过程中,当细胞外溶液的温度降到其平衡冻结点以下并达到一定的过冷度后,细胞外溶液首先结晶,水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩,电解质浓度显著增加,渗透压增高,pH值改变。
如果冷却速度较慢,细胞会因为长时间暴露于高浓度的溶液中而产生蛋白质变性和脱水性死亡,这就是所谓的溶质效应;当细胞内的水分结冰时,体积膨大,细胞内冰晶对细胞膜和细胞器膜就产生机械剪切破坏,谓之机械效应。
一般认为,冷却速率越快,机械损伤就越大。
血细胞干燥过程的损伤主要是膜的融合以及脂质的相转变。
在正常的生理环境下,细胞膜中磷脂的极性基团通过与水分子的结合而在空间上相互隔开,当水分子被除去后,极性基团的聚合密度增大,产生分子间的强相互作用,它们用极性基团间的氢键结合来弥补损失的与水分子的氢键结合,导致细胞膜大片融合、破损,内容物外溢[3];其次,血细胞在冻干过程中,细胞膜、细胞器膜经历液相向固相的相变过程,即膜脂质的物理状态的改变,磷脂双层除去氢键键合的水,将使丙烯酰基拉近,增加范德华力,结果脂类可以从液晶态转变成凝胶态[4]。
当再水化时,在室温为凝胶态的干膜又转变成液晶态,造成膜通透性增加[5]。
2 海藻糖的生物学特性及其在冻干保存中的作用机制2.1 海藻糖的生物学特性 海藻糖具有特有的物理和化学性质,这些特有的性质包括:①特强水合能力。
Kawai等[6]研究显示,以每个葡萄糖单位周围的不冻水分子数计算,海藻糖的不冻水分子是糖类最多的。
Magazù等[7]比较了海藻糖/水和蔗糖/水在玻璃化相转变附近的振动性质,认为海藻糖抗冷冻脱水的能力更强。
②独特的玻璃化转变及晶型转变特性。
海藻糖的玻璃化相变温度(Tg)是120℃,远高于其他双糖体系。
高的Tg可使样本在干燥时及以后的保存中有更高的稳定性[8]。
此外,高浓度的海藻糖溶液比其他糖类更不容易形成冰晶。
Sussich等[9]研究发现,细菌脱水时获得的休眠状态不仅与海藻糖较高的Tg导致黏度增加有关,还与水分失去时晶型分子排列的变化有关。
他们发现了一种无水晶态海藻糖分子。
这种晶态的化合物具有独特的可逆性吸收水分,转化成二水化合物,而不改变主要结构特性的作用。
这种可逆的过程在海藻糖对生物细胞抗脱水能力的保护上起了非常重要的作用。
③抗高温潮湿作用。
Leslie等[10]报道,在有海藻糖存在的条件下冻干后的细菌具有高度的存活率。
进一步发现,用海藻糖作为冻干保护剂时,将冻干样品(细菌)长时间暴露在潮湿的高温条件下,细菌仍保持了高度活性。
2.2 海藻糖在冻干保存中的作用机制 海藻糖对细胞的保护机制一直是众多研究的热点,目前主要有以下两种观点。
2.2.1 水替代学说 生物体中的蛋白质、糖、脂肪和其他大分子物质均被一层水膜保护着。
在干燥过程中,水分逐渐消失,导致这些大分子物质发生不可逆的变化,如蛋白质分子的空间结构的变化。
Cr owe 等[11]认为,当蛋白质结构水失去时,海藻糖可在失水部位以羟基和分子形成氢键,及时形成新的保护膜以替代原先失去的结合水膜,这使得分子在缺水条件下仍能保持其原有结构,而不丧失活性。
脱水过程中,海藻糖一方面能和磷脂形成氢键,抑止膜泡聚合,另一方面在高温下能有效降低膜相变温度,防止再水化时发生吸水破坏。
2.2.2 玻璃态学说 多数研究者认为,海藻糖的玻璃化状态在长时间保存细胞活性中发挥了重要作用。
玻璃化状态对细胞膜的保护作用有以下几个方面:①玻璃化抑止降温时冰晶的形成,避免了深低温保存时细胞受到的冰晶伤害和由于局部离子浓度过高而造成的化学伤害[3];②玻璃化则可以降低解链温度(T m),尽可能地保持胞膜的流动状态。
在冻干脂质体的研究中,当有海藻糖的存在时,脂质体的T m在干燥状态时降低到-20℃,从而使脂质在干燥状态下仍能保持液晶态,再水化过程中也不出现脂质的相位转化[12]。
3 血细胞负载海藻糖的研究研究显示,只有当海藻糖分子分布于细胞膜两侧,且每个细胞内达到>10个分子时,才能起到在冻干过程中保护细胞膜完整性的作用[4]。
但海藻糖不具有渗透性,因此如何在不影响细胞结构的前提下将海藻糖有效地载入到细胞内,是首先要解决的问题。
国内外学者对将海藻糖导入血细胞的方法进行了深入的研究。
Wolkers等[13]对海藻糖导入人的血小板进行了研究,他们在37℃下将血小板与海藻糖负载缓冲液孵育4h,使海藻糖的负载率达到>50%。
该方法利用细胞内吞作用,不仅简单,而且载入的海藻糖在血小板内均匀分布。
Wolkers等[13]还发现,37℃孵育,胞外海藻糖浓度在0～35mmol/L 时,血小板对海藻糖的吸收率成直线上升。
当胞外海藻糖浓度达到75mmol/L时,海藻糖的摄取率反而下降,提示人血小板对海藻糖的摄取具有浓度依赖性。
N ie等[14]在海藻糖负载缓冲液中加入磷酸盐,在37℃下负载4h,结果显示海藻糖和磷酸盐浓度都为45mmol/L时其导入血小板效率最高。
周新丽等[15]的研究表明,在细胞外海藻糖浓度为50mmol/L、负载温度37℃、负载时间4h的条件下,血小板能有效地吸收海藻糖,细胞内海藻糖浓度达到>15mmol/L。
对负载后的血小板进行形态观察、血液学分析和膜联蛋白V结合活化分析的结果显示,血小板的形态和功能正常。
Shirakashi等[16]在海藻糖负荷研究中,对哺乳动物细胞施行电打孔术。
尽管海藻糖可较容易的进人细胞内,但打孔后的细胞常常渗透脆性增加,不适合进一步冻干保存; Wolkers等[17]研究显示,红细胞对海藻糖的摄取明显依赖于孵育温度,而后者能影响红细胞胞膜的流动性。
4℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取率很低, 37℃时,摄取率明显增加。
红细胞对海藻糖最大的摄取量(胞内海藻糖浓度大约为55mmol/L)发生在37℃,此时的红细胞膜磷脂处于液晶态;Sat pathy 等[18]研究发现,当胞外海藻糖浓度<600mmol/L 时,红细胞对海藻糖没有明显的摄取。
这说明其摄取机制可能并不是易化扩散,因为易化扩散可以在很低的胞外介质浓度时发生。
但当胞外海藻糖浓度>600mmol/L时,红细胞对其的摄取开始增加,似乎又表明海藻糖的跨膜转运能量有部分是来源于细胞内外的渗透压差,增加细胞内外海藻糖的浓度梯度看来是海藻糖跨膜转运中首先出现的推动力。
随后他们等采用了一种有效的、温和的方法将海藻糖导入人红细胞。
这种方法基于红细胞胞膜的热性质并提供红细胞对海藻糖在37℃足够的吸收时间(7h)。
数据表明,通过细胞内外渗透压不平衡和磷脂相变的联合作用可使红细胞内海藻糖浓度达到50mmol/L[18]。
4 海藻糖在血细胞冷冻干燥保存中的研究进展4.1 在血小板冻干保存中的应用 Wolkers等[19]利用血小板在37℃对海藻糖高效率吸收的特点,将载入海藻糖浓度>15mmol/L的血小板冻干至残余水含量为3%～5%。